ARTIGO

O cardo e a indústria de queijo: ferramentas biotecnológicas para a produção de enzimas utilizadas na coagulação do leite

Thistle and the cheese industry: biotechnological tools for the production of enzymes for milk coagulation

André Folgado & Rita Abranches*

Plant Cell Biology Laboratory, Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier ITQB NOVA, Universidade Nova de Lisboa, 2780-157 Oeiras, Portugal

(*E-mail: ritaa@itqb.unl.pt)

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RESUMO

Em Portugal, como noutros países da bacia mediterrânica, a planta de cardo (Cynara cardunculus L.) tem sido utilizada desde tempos antigos para diversas aplicações nas áreas alimentar e da saúde. Em particular, no caso da produção artesanal de queijo de cabra e ovelha, a flor do cardo tem sido usada, muitas vezes de uma forma empírica, no processo de coagulação do leite. Esta utilização deve-se ao facto da flor possuir um conjunto de enzimas, nomeadamente proteases aspárticas, que influenciam o sabor e textura característicos destes queijos. Mais recentemente, as ferramentas desenvolvidas pela biotecnologia abrem novas perspectivas para uma produção de queijo em condições controladas e a um preço mais baixo. Neste artigo é apresentada uma revisão das ferramentas biotecnológicas disponíveis e das suas potenciais aplicações nesta indústria com importante impacto a nível nacional.

Palavras-chave: cardo, queijo, protease, cardosina, proteína recombinante.

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ABSTRACT

In Portugal, as in other countries of the Mediterranean basin, the thistle plant (Cynara cardunculus L.) has been used since ancient times for several applications in the food and health areas. In particular, in the case of artisanal goat and sheep cheese production, the thistle flower has been used, often empirically, in the milk coagulation process. This is due to the presence of a set of enzymes in the flower, in particular aspartic proteases that influence the flavor and texture characteristic of these cheeses. More recently, tools developed by biotechnology open up new prospects for controlled and low-priced cheese production. This article reviews existing biotechnology tools and their potential application in this industry with an important national impact.

Keywords: cardoon, cheese, protease, cardosin, recombinant protein.

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INTRODUÇÃO

Cynara cardunculus L., vulgarmente conhecido por cardo ou cardo-do-coalho, é uma planta da família Asteraceae (Compositae). Alguns autores consideram que C. cardunculus inclui duas subespécies: subsp. cardunculus e subsp. flavescens Wiklund (Wiklund, 1992; Devesa e López Martinez, 2014). Outros autores consideram que a espécie inclui três variedades: o cardo silvestre (var. cardunculus, por vezes designada “var. sylvestris”), o cardo cultivado (var. altilis DC.) e a alcachofra (var. scolymus (L.) Fiori) (Rottenberg e Zohary, 1996; Sonnante et al., 2007b; Acquadro et al., 2017, Pavan et al., 2018). A alcachofra é por vezes tratada como uma espécie diferente (C. scolymus L.). No entanto, cruzamentos entre alcachofra, cardo cultivado e cardo silvestre originam híbridos totalmente férteis (Rottenberg e Zohary, 1996), sendo o cardo silvestre considerado o ancestral do cardo cultivado e da alcachofra (Acquadro et al., 2017). Há evidências de que a alcachofra terá sido domesticada nos tempos romanos na Sicília (Mauro et al., 2009), enquanto o cardo poderá ter sido domesticado mais tarde no Mediterrâneo ocidental, possivelmente em Espanha ou França (Rottenberg e Zohary, 1996, Sonnante et al., 2007a,b; Pavan et al., 2018). A espécie ocorre naturalmente em toda a região Mediterrânica e na Macaronésia (Ilhas Canárias), tendo sido introduzida na América e na Austrália, onde se encontra naturalizada (Devesa e López Martinez, 2014).

Cynara cardunculus é uma espécie diploide (2n = 2x = 34), de polinização cruzada, apresentando um elevado grau de heterozigotia (Sonnante et al., 2007b; Acquadro et al., 2017). É uma planta perene que cresce até 2 metros de altura no caso do material cultivado, enquanto o material silvestre normalmente não ultrapassa os 110 cm de altura (Wiklund, 1992; Devesa e López Martínez, 2014). As suas folhas são penatipartidas ou penatifendidas, com margem espinhosa, verde-acinzentadas na parte superior e mais claras na parte inferior. Os capítulos são terminais, solitários ou têm inflorescências complexas mais ou menos corimbiformes, e estão envolvidas por brácteas coriáceas (Devesa e López Martinez, 2014). As flores têm corolas tubulosas, azul-violeta ou roxas. É uma planta adaptada às condições secas do Mediterrâneo, onde a maior parte da precipitação ocorre durante o inverno. O cardo cultivado é germinado a partir da semente e usado como uma planta anual, enquanto a alcachofra é geralmente propagada vegetativamente (Sonnante et al., 2007b).

A sequência do genoma de C. cardunculus var. scolymus foi publicada recentemente (Scaglione et al., 2016; www.artichokegenome.unito.it), o que veio permitir ampliar diversos estudos genéticos. Novas ferramentas, incluindo a anotação de micro RNAs, estão agora disponíveis para um vasto leque de estudos (Acquadro et al., 2017). Nos últimos anos, a diversidade genética desta espécie tem sido estudada através da avaliação morfológica, mas também recorrendo à utilização de marcadores moleculares (Pagnotta et al., 2017; Barracosa et al., 2018a). A avaliação da diversidade genética é importante não só para a caracterização da espécie mas também para a identificação de germoplasma que deve ser conservado ou aquele que se está a perder ou em risco de extinção.

No que diz respeito às condições de ecologia e aspectos agronómicos deste espécie, Gominho et al. (2018) apresenta, num artigo recente, uma extensa revisão e informações detalhadas. Apesar da inexistência de um programa nacional de melhoramento genético em cardo, alguns projetos têm sido realizados de forma a atuar sobre os problemas que envolvem a sua exploração e ao mesmo tempo contribuir para a valorização de um recurso endémico que, apesar de ser economicamente explorado, não tem sido alvo de programas de valorização. O projecto CARDOP (http://cardop-queijoserradaestrela.blogspot.com) liderado pelo Instituto Politécnico de Viseu, o projecto iCheese (https://inovacao.rederural.gov.pt/13-projectos-groupos-operacionais/60-icheese-cynara-innovation-for-best-cheese) liderado pela Universidade Católica Portuguesa, e também o projecto ValBioTec Cynara (http://www.iniav.pt/menu-lateral-geral/projetos-de-investigacao/valbiotec) liderado pelo Centro de Biotecnologia Agrícola do Alentejo (CEBAL), são exemplos de projectos nacionais concebidos para promover o uso do cardo, não só no que à sua dimensão na produção de queijo diz respeito, mas de forma integral, explorando o cardo como um todo, aproveitando todas as partes da planta que, graças às suas características, possibilitam diferentes áreas de exploração económica.

AS DIVERSAS APLICAÇÕES DE CYNARA CARDUNCULUS

A utilização desta espécie pelo ser humano tem tido ao longo do tempo diversas aplicações: o talo para alimentação, as folhas que contêm numerosos compostos químicos com aplicação na saúde, o aproveitamento da biomassa, o fabrico de biodiesel, e finalmente a utilização das flores na manufactura do queijo que constitui o foco deste artigo.

A alcachofra é conhecida desde o século IV a.C. para fins alimentares e medicinais. Esta planta era apreciada pelos antigos egípcios, gregos e romanos, que a utilizavam como alimento e também como como medicamento devido aos seus efeitos benéficos contra doenças hepato-biliares e para facilitar a digestão (Lattanzio et al., 2009). Os extratos de folha de alcachofra são usados na medicina popular, particularmente para tratar problemas de fígado, mas também pelo seu efeito diurético e colagogo, apresentando também alguma atividade colerética e antidiabética (Lattanzio et al., 2009). De facto, a espécie Cynara cardunculus apresenta numerosas aplicacões em farmacologia uma vez que diferentes tecidos da planta constituem fontes naturais de compostos bioactivos. Além disto, o cardo tem um importante papel na nutrição humana, devido ao seu alto teor de compostos nutracêuticos e bioativos, como a inulina e os fenólicos antioxidantes (Pandino et al., 2011). Entre os compostos mais estudados encontram-se os ácidos mono- e di-cafeoilquínico e as lactonas sesquiterpénicas. Em particular as lactonas sesquiterpénicas constituem uma classe de terpenóides muito diversos em termos da sua estrutura e propriedades, que desempenham um papel fundamental na interação entre plantas e ambiente e possuem propriedades aleloquímicas, dissuasivas e inseticidas. Os extratos de cardo demonstraram ainda atividade antitumoral (Mileo et al., 2012) e antibacteriana (Lattanzio et al., 2009). Em particular o composto cinaropicrina, presente nas folhas de cardo, já foi identificado como anti-cancerígeno e a sua ação em linhas tumorais tem sido amplamente estudada (por exemplo Eljounaidi et al., 2015; Ramos et al., 2017). A caracterização química dos extractos lipofilicos de folha de Cynara cardunculus L. var. altilis levou à identificação de novos compostos, no entanto as lactonas sesquiterpénicas e triterpenos pentacíclicos foram as famílias lipofilicas mais prevalentes (Ramos et al., 2013). No que diz respeito às flores, o estudo recente de Dias e colaboradores elaborou uma caracterização do perfil fenólico e da bioatividade de extratos de diferentes genótipos de C. cardunculus, com o foco particular nos estigmas da inflorescência, devido à sua utilização na produção de queijo (Dias et al., 2018). Os compostos prevalecentes foram a apigenina e os derivados de ácido cafeoilquínico. Além da forte atividade antioxidante, as inflorescências do cardo também apresentaram atividade antibacteriana (Dias et al., 2018).

O cardo também pode ser explorado para a produção de biomassa lignocelulósica e óleo de sementes (Curt et al., 2002; Fernández et al., 2006), produção de forragem verde para a pecuária (Cajarville et al., 1999), biomassa seca para produção de energia (Oliveira et al., 2012; Gonzalez et al., 2014), matéria-prima para polpa de celulose e para madeira prensada (Gominho et al., 2001, 2011, 2018) e biodiesel (Sengo et al., 2010).

Por último, a utilização do cardo na manufactura do queijo. Embora os coalhos de origem animal tenham sido provavelmente os primeiros coagulantes enzimáticos utilizados, os coalhos produzidos a partir de plantas, como por exemplo figos e cardo, parecem ter sido comuns na época romana (Fox et al., 2017). Esta aplicação do cardo irá ser desenvolvida com mais detalhe nas seções seguintes, onde serão também apresentadas as possibilidades alternativas existentes nomeadamente as que tiram partido de ferramentas biotecnológicas.

UTILIZAÇÃO DA FLOR DE CARDO COMO AGENTE COAGULANTE NA PRODUÇÃO DE QUEIJO

Em Portugal, a principal exploração económica do cardo é a utilização da sua flor na produção de queijo. No entanto, a flor é uma matéria-prima bastante onerosa para o sector; o preço depende da qualidade, variando geralmente entre 25 e 60 euros por quilo mas podendo chegar até aos 100 euros em situações de escassez (comunicação pessoal, Pedro Louro (INIAV) e Paulo Barracosa (IP Viseu)). Tal como referido anteriormente, a utilização da flor de cardo como agente na coagulação do leite é possível devido à presença de enzimas proteolíticas denominadas proteases aspárticas (PA). Estas enzimas são responsáveis pela quebra da principal proteína do leite designada caseína. A caracterização destas proteases reveste-se de grande importância uma vez que influenciam as características específicas dos vários queijos, nomeadamente em termos de textura e sabor. Neste sentido, diversos grupos de investigação têm vindo a dedicar-se ao estudo destas enzimas, com vista a permitir no futuro utilizar ferramentas biotecnológicas para melhorar os processos de produção. Estas proteases aspárticas estão presentes nos pistilos da flor e são designadas ciprosinas e cardosinas (Cordeiro et al., 1994; Veríssimo et al., 1995). A diferente designação destas enzimas está relacionada com os diferentes autores que as estudaram bem como as diferenças ao nível do processo de purificação utilizado aquando da sua identificação. Até agora, foram identificadas 9 PA diferentes na flor de cardo (Cordeiro et al., 1994; Verissimo et al,. 1996; Sarmento et al., 2009), que pertencem a uma família multi-génica (Pimentel et al., 2007). De todas as proteínas identificadas, apenas as cardosinas C e D ainda não foram encontradas na flor de cardo sob a forma de proteína, havendo apenas informação sobre a sequência dos genes (ver Quadro 1).

As várias PA encontradas na flor do cardo apresentam diferentes atividades sobre as caseínas do leite sendo estas diferenças bem evidentes entre as cardosinas A e B. A cardosina A é mais especifica e menos proteolítica que a cardosina B na sua ação sobre as caseínas, sendo a sua atividade mais semelhante à da quimosina animal que é a enzima mais utilizada pela indústria do queijo a nível mundial. Por outro lado, a cardosina B é mais proteolítica e menos especifica que a cardosina A, sendo a sua atividade mais semelhante à da pepsina animal (Verissimo et al., 1995).

A diferença na atividade das enzimas está relacionada com a ação que têm sobre as proteínas que constituem o leite. O leite é constituído maioritariamente por proteínas designadas caseínas. As caseínas do leite formam uma estrutura micelar constituída por a, b e k-caseínas. A a e a b-caseína são compostas por estruturas hidrofóbicas enquanto que a k-caseína é constituída por estruturas hidrofóbicas e hidrofilicas. Assim, a k-caseína é responsável pela estabilização do micelo e permite que este seja solúvel (Waugh e Von Hippel, 1956). A coagulação do leite ocorre devido à destabilização deste complexo por ação enzimática sobre a k-caseína. A hidrólise da k-caseína leva a que as estruturas hidrofóbicas fiquem expostas, promovendo a ligação dos micelos de caseína entre si, formando uma rede que conduz à formação do coalho do leite. Durante o processo de sinérese, que consiste na libertação de água da coalhada, as estruturas hidrofilicas permanecem no soro do leite, assim como grande parte das enzimas utilizadas neste processo (Walstra, 1993). A quimosina, que é a principal enzima utilizada na indústria dos lacticínios, tem uma atividade muito especifica sobre a k-caseína, cortando apenas na posição dos aminoácidos Fen₁₀₅-Met₁₀₆ da proteína. Esta ação leva à produção de dois péptidos designados para-k-caseína e macro-péptido (Delfour et al., 1965). A ação das PA da flor do cardo sobre as caseínas também é caracterizada pela mesma ação sobre a k-caseína na posição Fen₁₀₅-Met₁₀₆ (Macedo et al., 1993), no entanto, a ação proteolítica é mais extensa que a da quimosina, ocorrendo também cortes noutras posições das restantes caseínas (Silva e Malcata, 1998, 1999, 2005; Silva et al., 2003). Esta atividade mais alargada sobre as caseínas é apontada como uma das razões para o aparecimento de sabores amargos e picantes no queijo produzido com estas enzimas (Agboola et al., 2004). As diferentes PA da flor do cardo, apesar de em alguns casos apresentarem uma grande percentagem de similitude, têm atividades específicas sobre as caseínas que são diferentes entre si. Além disto, a quantidade de cada PA presente na flor do cardo varia entre ecótipos, havendo genótipos com diferentes quantidades de cada enzima e outros em que algumas enzimas estão  ausentes (Barracosa et al., 2018b). Assim, a utilização do extrato de flor do cardo como agente de coagulação do leite está muito dependente da presença e da atividade especifica das diferentes PA, fator que contribui, em parte, para a variabilidade encontrada no extrato produzido a partir da flor do cardo e utilizado no fabrico dos queijos.

VARIABILIDADE GENÉTICA E IMPACTO NO FABRICO DE QUEIJO

A utilização de flor do cardo na produção de queijo está intrinsecamente associada à produção de queijo de Denominação de Origem Protegida (DOP). Para os queijos poderem adquirir esta classificação, a sua produção tem que ser feita, obrigatoriamente, com a utilização de flor de cardo como agente de coagulação do leite. Além disso, o leite utilizado tem que ser obtido a partir de raças autóctones e ser produzido na área geográfica definida no caderno de especificações e regulado pela legislação em vigor (ver por exemplo DR-Despacho n.º 4183/2011 relativo ao queijo da Serra da Estrela). Segundo Almeida & Simões (2018), existem sete queijos portugueses de cabra ou ovelha com a designação DOP, que utilizam somente extratos de flor de cardo como coagulante. Estes queijos apresentam propriedades sensoriais e de textura únicas, as quais são atribuídas a uma proteólise mais pronunciada da caseína por parte das enzimas do cardo, quando comparada com as de origem animal. Para uma revisão recente sobre este tema consultar Almeida e Simões (2018).

As flores utilizadas na produção de queijos DOP variam consoante o fabricante, sendo que alguns fabricantes utilizam flores de plantações próprias enquanto outros compram a flor a fornecedores ou em feiras regionais. Se no primeiro caso é possível garantir que a origem da flor é controlada, no segundo caso tal não é possível. Associado a isto, a inexistência de produtores de flor de cardo leva a que a colheita ocorra de forma aleatória e desordenada incluindo também plantas que crescem de forma espontânea na natureza. Fatores como a falta de controlo na origem da flor, das partes que são colhidas e do seu estado de secagem, contribuem para uma maior variabilidade no perfil de cardosinas e ciprosinas presentes durante o processo de produção do extrato enzimático. Esta variabilidade pode levar à obtenção de extratos com diferentes forças de coagulação que vão afetar o processo de fabrico dos queijos. A variabilidade dos extratos de flor de cardo usados no processo de coagulação do leite no fabrico de queijo tem sido tema de alguns estudos durante os últimos anos. Correia et al. (2016) avaliou o impacto de diferentes ecótipos de cardo na produção de queijo Serra da Estrela. Os autores utilizaram 4 ecótipos diferentes e mediram parâmetros como tempo de coagulação, textura, firmeza, peso e cor e realizaram também uma avaliação sensorial recorrendo a um painel de provadores. Os resultados obtidos mostraram grande variabilidade nos parâmetros medidos, especialmente em relação ao tempo de coagulação. A avaliação sensorial também mostrou diferenças significativas realçando o impacto que a escolha da flor tem no produto final (Correia et al., 2016). No entanto, os autores mediram a quantidade de cardosinas total e por isso não foi possível relacionar o tipo e conteúdo em cardosinas com o produto final (Correia et al., 2016). O tema da variabilidade encontrada nas populações de cardo foi recentemente abordado em dois estudos. O primeiro estudo abrangeu 6 ecótipos de cardo, tendo sido caracterizado, ao longo de três anos, o perfil em cardosinas em conjunto com a avaliação de 26 características morfológicas, de forma a averiguar alguma possível correlação entre o perfil enzimático e o fenótipo das plantas (Barracosa et al., 2018b). De acordo com este estudo, os perfis enzimáticos apresentaram variações na quantidade e também na qualidade de cardosinas nos ecótipos utilizados, não tendo sido possível encontrar correlação entre a morfologia e o perfil enzimático dos ecótipos. Foi no entanto possível detetar alguma estabilidade nos perfis enzimáticos dentro de cada ecótipo ao longo dos três anos de amostragens (Barracosa et al., 2018b). No segundo trabalho, foram caracterizarados extratos de flor de 15 ecótipos de cardo da região do Alentejo em relação à sua utilização como agente coagulante de leite tendo sido consideradas 13 caraterísticas técnicas para avaliar o desempenho de cada extrato na coagulação do leite (Gomes et al., 2019). Estes autores constataram mais uma vez a grande variabilidade existente nas diferentes populações de cardo, nomeadamente na sua utilização como agente coagulante, reforçando que a falta de controlo sobre a proveniência das flores e a sua mistura são fatores que contribuem para a imprevisibilidade associada ao uso do cardo na produção de queijo (Gomes et al., 2019). Estes trabalhos vêm demonstrar, a diferentes níveis, a grande variabilidade genética que caracteriza as populações de cardo e mostrar a sua influência no processo de fabrico de queijo e na qualidade do produto final. No Quadro 2 podem ser encontrados exemplos de coalhos de diferentes origens disponíveis no mercado.

POTENCIAL DE INOVAÇÃO E CRIAÇÃO DE NOVOS PRODUTOS

Os estudos realizados sobre a variabilidade das populações de cardo e o impacto que esta tem sobre o queijo produzido, vêm confirmar aquilo que já era empiricamente conhecido, sobre a variação dos queijos produzidos através da utilização de flor de cardo. O impacto que esta variabilidade tem sobre o processo de fabrico é muitas vezes reduzido devido à dimensão artesanal que caracteriza a produção de queijo com a utilização de cardo. No entanto, este fator limita a utilização da flor numa escala de produção industrial na qual a existência de variabilidade tem um impacto superior.

A utilização das flores do cardo na produção de queijo implica a influência da presença de todas, ou de grande parte, das PA da flor no processo de coagulação do leite. Tendo em conta que as diferentes PA têm atividades específicas, o produto final é o resultado da ação conjunta de várias PA, não sendo possível distinguir os contributos individuais de cada enzima. Assim, a aplicação prática do conhecimento gerado sobre as diferentes atividades e especificidades das PA ainda não é uma realidade. O conhecimento da atividade proteolítica e especificidade de cada enzima poderá ser um fator impulsionador e gerador de inovação ao nível da obtenção de novos produtos com o uso específico de uma enzima ou combinações das diferentes enzimas presentes no cardo. Alguns estudos foram já realizados com o objetivo de desenvolver sistemas alternativos para a expressão e produção das PA de cardo. O primeiro sistema a ser explorado foi a utilização de cultura de tecidos da própria planta de cardo. Figueiredo et al. (1987) estabeleceu culturas de células em suspensão a partir de folhas de cardo com o intuito futuro de utilizar estas células indiferenciadas como fonte alternativa de PA de cardo. Neste trabalho, foram estabelecidas com sucesso as culturas de células indiferenciadas e optimizado o meio de cultura usado na sua indução. Mais tarde, Lima-Costa et al. (1996) estudaram o crescimento destas culturas em sistema contínuo em quimiostato e mediram a atividade proteolítica e a produção de fenol tendo comparado a produção destas culturas em batch. As culturas em quimiostato demonstraram uma maior atividade proteolítica total sem a produção de fenol em comparação com as culturas em batch. No entanto, a classe das proteases não foi determinada e como tal não foi possível estabelecer se a actividade proteolítica medida se deveu à actividade de PA (Lima-Costa et al., 1996). Estas culturas foram posteriormente caracterizadas em relação à expressão de PA; Oliveira et al. (2010) estudaram a expressão das cardosinas A e B em callus de cardo e demonstraram a produção de novo destas cardosinas, sendo estas acumuladas ao nível do retículo endoplasmático no seu estado não processado. Para se encontrarem no estado processado, estas PA passam por processos sucessivos de ativação em que segmentos da sequência são removidos de forma a tornar as PA ativas. Entre estas partes removidas encontram-se o prosegmento e o Plant Specific Insert (PSI) (Castanheira et al., 2005). Este trabalho permitiu demonstrar que estas culturas produzem cardosinas, mas o seu processamento é diferente daquele encontrado ao nível das flores (Oliveira et al., 2010). Assim, o uso de culturas de callus de cardo como fonte alternativa de PA não representa uma solução viável. A produção à escala industrial destas enzimas tem que ter por base um sistema que permita escalabilidade. Nesse sentido, a expressão de ciprosina B, outra PA presente nas flores de cardo, foi estudada em Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae. A expressão em Pichia pastoris de ciprosina B resultou na sua acumulação no meio de cultura na sua forma processada, no entanto, o processamento da enzima levou a uma remoção incompleta do PSI, originando uma forma que difere da ciprosina B encontrada na flor de cardo. Isto conduz a diferenças em termos de estrutura e eficiência catalítica (White et al., 1999). O mesmo foi observado, mais recentemente, com a expressão de uma PA de Galium verum L., também conhecida por erva-coalheira, em Pichia pastoris (Feijoo-Siota et al., 2018). A expressão em Saccharomyces cerevisiae originou diferentes resultados: neste sistema, a ciprosina B recombinante foi em parte secretada para o meio de cultura na sua forma ativa e inativa, no entanto, o processo de secreção é limitado e uma parte significativa foi retida dentro das células. Isto torna o processo de fermentação dependente da produção de biomassa e limita o seu uso industrial (Sampaio et al., 2008). Noutro estudo, Sampaio et al. (2010), procederam à produção de ciprosina B recombinante através da transformação genética de callus de cardo de forma a sobreexpressar a ciprosina B e caracterizaram a sua produção em bioreactor. Os autores demonstraram a capacidade deste sistema para produzir a ciprosina B na sua forma ativa, sendo esta acumulada dentro das células. Apesar de ter sido possível purificar a proteína, a quantidade produzida é ainda fator limitante para o seu uso a uma escala industrial (Sampaio et al., 2010). Estes estudos permitiram perceber que a forma de expressão desta enzima em sistemas alternativos está muito dependente do sistema utilizado. De facto, um dos problemas associados à produção de PA de cardo em sistemas heterólogos, é o seu diferente comportamento nestes sistemas. Um sistema que funcione para uma enzima poderá não funcionar para outra. Mais recentemente, Almeida et al. (2015) desenvolveram uma estratégia que permite a produção e secreção de cardosina B sintética em levedura recorrendo a técnicas de engenharia de proteínas. Neste trabalho, as alterações introduzidas na estrutura da enzima caracterizam-se pela remoção do PSI e pela união das duas subunidades através de um linker constituído por glicinas. Esta estratégia permitiu que esta forma sintética da cardosina B fosse produzida e secretada para o meio de cultura na sua forma inativa, sendo necessário um passo posterior de ativação para obter a enzima funcional (Almeida et al., 2015). Neste trabalho foi também demonstrada a aplicação prática do extrato enriquecido com esta forma alternativa da cardosina B, designado VRen, na produção de queijo (Almeida et al., 2015). O impacto destas alterações estruturais na atividade e especificidade da enzima foram estudadas e revelaram que, para além de permitirem a secreção para o meio de cultura, estas também originaram alterações ao nível da especificidade da proteína, tornando-a mais especifica e menos proteolítica (Almeida et al., 2017). Estes trabalhos vêm demonstrar a possibilidade da produção em larga escala da cardosina B sintética e o enorme potencial de inovação que existe com a aplicação de engenharia de proteínas.

PERSPECTIVAS FUTURAS

Nos últimos anos, diferentes estratégias têm vindo a ser desenvolvidas em busca de formulações mais standardizadas das enzimas nativas, ou com vista à sua produção em sistemas heterológos. A nossa equipa em particular, tem vindo a desenvolver sistemas alternativos, baseados em plantas, para a produção de proteínas recombinantes de diversas origens, nomeadamente enzimas utilizadas em alimentação animal (fitase, um aditivo de ração animal) e proteínas humanas com impacto na área da saúde, tais como a hormona Eritropoeitina e a enzima prostaglandina D sintase (Abranches et al., 2005; Pires et al., 2008, 2012, 2014). Mais recentemente, temos focado a nossa atenção na utilização de culturas de células em suspensão da planta leguminosa Medicago truncatula Gaertn. e de tabaco (Nicotiana tabacum L.) (Santos et al., 2016, 2017, 2018, 2019). Neste âmbito, temos vindo a desenvolver sistemas alternativos para a produção das proteases aspárticas do cardo, em particular as cardosinas A e B, de modo a obter uma fonte segura e económica, de origem vegetal, para a produção de enzimas para coagulação do leite de cabra e ovelha. Estes sistemas permitem além disso, a produção de várias enzimas em simultâneo, produzidas em quantidades diferentes através da utilização de sequências de promotores com diferentes forças, de modo a conseguir um balanço adequado entre todos os componentes do coalho. Por essa razão é tão importante a caracterização pormenorizada das várias proteases presentes na flor do cardo e a compreensão do modo como cada uma delas contribui para uma determinada característica do queijo. Além dos sistemas de culturas de células em suspensão, estamos também a investir no estabelecimento de culturas de hairy roots, uma plataforma de produção mais especializada do que as células em suspensão que são indiferenciadas, pois as hairy roots são tecidos diferenciados e permitem obter outro tipo de produtos. Esperamos no futuro breve poder contribuir para o aparecimento de novas ferramentas biotecnológicas para a manufactura do queijo de cabra e ovelha para aplicação em diferentes sectores: um sector mais especializado, se for usada apenas uma determinada enzima com vista a uma determinada característica de sabor ou textura; queijos com custo de produção menor como os queijos de qualidade elevada mas sem selo DOP; ou para exportação no caso de mercados externos onde não existem estes requisitos.

 

Referências bibliográficas

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Agradecimentos

Os autores agradecem a Susana S. Neves pela revisão da descrição botânica da espécie e Ana Paula Santos pela leitura crítica do manuscrito.

Este trabalho foi financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT, Portugal) através do projecto “Proteases from Cynara cardunculus L.: study of gene expression and establishment of alternative production platforms” (ref. PTDC/BAA-AGR/30447/2017), a unidade de investigação Bioresources 4 Sustainability (ref. UID/Multi/04551/2013), e a bolsa de doutoramento de AF (ref. PD/BD/114488/2016).

 

Recebido/received: 2019.03.29

Aceite/accepted: 2019.05.24