INTRODUCCIÓN

Las malas hierbas son consideradas una de las principales limitaciones de la producción agrícola, ya que interfieren o alteran las funciones de crecimiento y desarrollo de los cultivos (^{Laosinwattana et al., 2018}). La aplicación intensiva de herbicidas químicos con similares modos de acción ha aumentado el riesgo de toxicidad para los animales, las plantas, la salud humana y el medio ambiente (^{Petroski & Stanley, 2009}), además de favorecer la aparición de resistencias (^{Dayan & Duke, 2014}). Por lo tanto, existe una necesidad urgente de descubrir nuevos herbicidas basados en aleloquímicos con modos de acción novedosos, sostenibles y seguros (Dayan & Duke, 2014).

Cistus ladanifer L. (Cistaceae) es un arbusto nativo de la región Mediterránea, que se encuentra ampliamente distribuido en áreas degradadas y no cultivadas de la Península ibérica (^{Frazão et al., 2018}). En los últimos años, los productos derivados del metabolismo secundario de esta especie, entre los que destaca el aceite esencial, han despertado un gran interés, no solo por sus propiedades aromáticas y fijadoras, sino también por su importancia biológica para la industria farmacológica y agroalimentaria. En este sentido, aunque varios autores han evaluado el efecto fitotóxico del aceite esencial de C. ladanifer en algunas malas hierbas y cultivos (^{Verdeguer et al., 2012}; ^{Benali et al., 2020}; ^{Pérez-Izquierdo et al., 2022}), no hay estudios previos que evalúen este efecto sobre Echinochloa crus-galli y que, además, tengan en cuenta el estado fenológico de la planta en el momento de la extracción del aceite esencial. Por tanto, el objetivo principal de nuestro estudio fue evaluar el impacto del estado fenológico de la planta sobre la composición química y el potencial bioherbicida del aceite esencial de Cistus ladanifer L. sobre E. crus-galli así como la selectividad frente a cultivos donde esta mala hierba está presente, como son arroz y tomate.

MATERIALES Y MÉTODOS

El material vegetal se recolectó en una población natural de C. ladanifer situada en el noroeste de Extremadura (Guijo de Granadilla, España). Se recolectaron las partes aéreas jóvenes de un mínimo de veinte plantas para dos estados fenológicos muy contrastados (inicio y final de maduración del fruto, en agosto y octubre respectivamente). La extracción del material vegetal se llevó a cabo por hidrodestilación con un aparato tipo Clevenger. La duración de la extracción fue de 3 h y se emplearon aproximadamente 200 g de material vegetal seco. El aceite esencial se separó por decantación y se almacenó a -18ºC hasta su uso. Los compuestos volátiles del aceite esencial se determinaron por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). La identificación individual de los compuestos se realizó comparando sus Índices de Retención con bibliografía y sus espectros de masas con librerías (NBS75K). El porcentaje de composición relativa (%) de cada compuesto individual se calculó dividiendo cada área de pico individual entre el área total del cromatograma.

Las semillas de E. crus-galli fueron proporcionadas por el Área de Protección Vegetal de CICYTEX, y provienen de prospecciones realizadas en diferentes cultivos en Extremadura. La actividad fitotóxica del aceite esencial sobre semillas de E. crus-galli, arroz (var. Gladio) y tomate se evaluó mediante bioensayos en placa Petri. Para ello. se colocaron lotes de diez semillas previamente desinfectadas en placas de Petri de 90 mm de diámetro sobre dos capas de papel de filtro Whatman nº 1. El papel de filtro se humedeció con 2 ml de agua destilada y el aceite esencial se depositó como una sola gota en el centro de las placas. Se ensayaron tres dosis crecientes de aceite esencial (0,022; 0,044 y 0,088 μl/mL de espacio libre en la placa Petri) y un control sin aceite esencial. Se prepararon 5 repeticiones por estado fenológico, dosis y especie. Las placas Petri se sellaron con Parafilm y se incubaron a 25 °C en oscuridad. Al cabo de 7 días, se registró el porcentaje de germinación y la longitud de las plántulas. Se calculó el índice de germinación (IG) para cada especie, según la siguiente fórmula: IG = G/Gc x L/Lc, donde G y Gc son los porcentajes de germinación en las placas tratadas y control, respectivamente, y L y Lc son las longitudes medias de las plántulas en las placas tratadas y control, respectivamente.

Debido a la falta de normalidad y homocedasticidad en los datos, el efecto del tratamiento con hidrolato sobre el IG de las semillas se analizó mediante la prueba no paramétrica Anova de Rangos Alineados de dos vías (AnovaRA), incluyendo en interacción los factores: estado fenológico, dosis y especie. Se empleó el test de Tukey (HSD) a un nivel de significación P<0,05 para comparar las medias. Todos los análisis se realizaron con el software estadístico R Core Team (2022).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se identificaron un total 103 compuestos en el análisis GC-MS, de los que 21 fueron considerados mayoritarios (porcentaje relativo ≥ 1%) en el aceite esencial. Estos componentes mayoritarios representaban el 57,95 y 60,20 % del total integrado en el análisis cromatográfico y sus porcentajes relativos se detallan en la Tabla 1. El grupo más representativo del aceite esencial fueron los sesquiterpenos oxigenados (35,63-28,69 %), mientras que los principales componentes del aceite esencial fueron viridiflorol (20,38-15,97 %), α-pineno (3,38-12,91%) y ledol (8,92-7,26 %). De este modo, comparando nuestros resultados con los obtenidos en otras zonas cercanas de España y Portugal, los principales compuestos identificados son similares a los encontrados en otros estudios (^{Xavier et al., 2021}; ^{Pérez-Izquierdo et al., 2023}), pero las proporciones de cada uno de ellos difieren significativamente. Finalmente, la composición química varió considerablemente entre los estados fenológicos testados.

Figura 1 Efecto de diferentes dosis (µl/ml) de aceite esencial de Cistus ladanifer extraído en dos fechas contrastadas sobre el índice de germinación de las semillas de Echinochloa crus-galli, arroz y tomate. Los valores se expresan como media ± sd (n = 5). Para cada fecha y dosis, letras diferentes indican diferencias significativas entre diferentes especies (AnovaRA seguido del test de Tukey (P<0,05)). 

La Figura 1 muestra el efecto del aceite esencial de C. ladanifer sobre el índice de germinación de las semillas de E. crus-galli, arroz y tomate. El AnovaRA de tres vías para el índice de germinación mostró un efecto significativo (P<0,05) en los tres factores analizados, pero no para la interacción entre ellos (F_4,72 = 1,03; P = 0,396). El aumento de la dosis de aceite esencial provocó un descenso progresivo en el índice de germinación en las tres especies testadas, alcanzando una inhibición prácticamente total a la dosis más elevada (0,08 µl/ml). Sin embargo, a dosis medias y bajas (0,022 y 0,044 µl/ml), este efecto fitotóxico fue significativamente mayor (P<0,05) en E. crus-galli comparado con arroz y tomate. Finalmente, el aceite esencial de muestras recolectadas en octubre, el cual presentaba porcentajes más elevados de monoterpenos hidrocarbonados, mostró un efecto significativamente mayor (F_1,72 = 25,55; P<0,001) sobre el índice de germinación que aquel proveniente de la recolección en agosto.

En general, nuestros resultados concuerdan con los mostrados en estudios anteriores, los cuales también evaluaron el potencial del aceite esencial de C. ladanifer para inhibir la germinación de semillas y el crecimiento temprano de plántulas. Así, se han descrito previamente efectos fitotóxicos del aceite esencial de C. ladanifer sobre tomate (^{Benali et al., 2020}), rabanito (^{Pérez-Izquierdo et al., 2022}) y malas hierbas (^{Verdeguer et al., 2012}). Hasta donde sabemos, algunos estudios han demostrado que los sesquiterpenos oxigenados son los principales responsables de los efectos fitotóxicos de los aceites esenciales (^{Elshamy et al., 2019}), mientras que otros autores han encontrado que los monoterpenos también son compuestos biológicamente activos con potencial fitotóxico (^{Kordali et al., 2007}). En este sentido, es probable que el potencial efecto fitotóxico de los aceites esenciales no sea directamente atribuible a uno o varios compuestos principales, sino al efecto sinérgico o antagónico resultante de la interacción entre todos los compuestos presentes.

CONCLUSIONES

Los resultados derivados de este estudio muestran el elevado potencial del aceite esencial de C. ladanifer para su empleo como bioherbicida en agricultura. Además, estos resultados apuntan también al impacto que el estado fenológico puede tener, no sólo sobre la composición química, sino también sobre la actividad fitotóxica del aceite esencial y sus posibles aplicaciones industriales.