RODRIGUES-PINTO, Ricardo; OLIVEIRA, António; RICHARDSON, Stephen M.    HOYLAND, Judith A.. Isolamento e caracterização das células da notocorda humana: Implicações para o desenvolvimento de terapias celulares para a doença degenerativa discal. []. , 21, 4, pp.443-472. ISSN 1646-2122.

^lpt^aIntrodução: Para o desenvolvimento de terapêuticas celulares para o tratamento da degeneração do disco intervertebral é necessário o conhecimento detalhado das células que o constituem e das vias moleculares que levam à sua diferenciação. O núcleo pulposo (NP) embrionário, fetal e dos primeiros anos de vida é formado por células grandes e vacuoladas da notocorda; no entanto, com a maturidade esquelética, as células da notocorda desaparecem e são substituídas por células menores, semelhantes a condrócitos. Estudos animais e in vitro demonstraram que as células da notocorda exercem efeitos anabólicos e protetores sobre o disco intervertebral, pelo que o seu desaparecimento do NP humano tem sido implicado na patogénese da degeneração discal. Deste modo, o estudo destas células e dos seus mecanismos de regulação poderá identificar fatores envolvidos na homeostasia do disco intervertebral e ajudar no desenvolvimento de terapêuticas celulares para regenerar ou substituir as células do disco intervertebral degenerado. No entanto, o estudo de células da notocorda humana tem sido dificultado por restrições éticas, logísticas e técnicas, o que constitui uma importante limitação para o avanço científico nesta área. Este estudo foi realizado com o objetivo de isolar células da notocorda (precursoras do NP) das do esclerótomo (precursoras do anel fibroso (AF) e das vértebras) a partir de embriões e fetos humanos e caracterizar o seu fenótipo e os mecanismos ou moléculas reguladores da sua função no disco intervertebral. Métodos: Embriões e fetos humanos (3.5 a 12 semanas pósconceção) foram dissecados e caracterizados morfologicamente para confirmar a presença de células da notocorda na coluna vertebral em desenvolvimento. Uma vez que nesta altura do desenvolvimento humano não existe uma demarcação óbvia dos limites entre o NP, o AF e o corpo vertebral, foi desenvolvida uma estratégia baseada na identificação de um marcador celular específico para as células da notocorda e na sua utilização para as separar das células do esclerótomo. Para identificar esse marcador realizou-se uma pesquisa da literatura; seguidamente, os potenciais marcadores foram testados por imunohistoquímica em secções embrionárias e fetais contendo células da notocorda. Após identificação do marcador a usar, e uma vez que esse tinha localização intracelular, foi desenvolvida uma metodologia que permitisse extrair RNA a partir de um número limitado de células fixadas, permeabilizadas, marcadas com um anticorpo fluorescente e separadas por citometria de fluxo. O método desenvolvido foi então utilizado para separar e extrair RNA a partir de células da notocorda e esclerótomo fetais. A precisão da separação foi confirmada pela quantificação por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR) da expressão de genes da notocorda nos dois tipos celulares separados. Posteriormente, microarrays foram utilizados para identificar o fenótipo e o software interactive pathway analysis (IPA®) foi utilizado para identificar moléculas e fatores reguladores da função das células da notocorda. Resultados: A coluna vertebral fetal humana foi validada como uma fonte adequada para obtenção de células da notocorda. A pesquisa da literatura identificou 16 potenciais marcadores específicos destas células e a validação de um grupo deles identificou as moléculas KRT8, KRT18 e KRT19 como sendo específicas para as células da notocorda da coluna vertebral fetal humana. Verificou-se que uma metodologia consistindo na fixação e permeabilização de células com 95% etanol/ 5% ácido acético, marcação com um anticorpo fluorescente anti-KRT18 e separação por citometria de fluxo permitia obter RNA de elevada qualidade. Esse método foi utilizado para separar células extraídas enzimaticamente da coluna fetal humana e separar as células da notocorda (precursoras do NP e KRT18-positivas) das células do esclerótomo (precursoras do AF e das vértebras e KRT18-negativas). A maior expressão diferencial dos genes da notocorda KRT18, KRT19, brachyury, Galectin 3, CTGF e FOXA2 pelas células KRT18-positivas confirmou a precisão da separação. A análise dos dois tipos celulares por microarrays identificou 782 genes regulados positivamente e 678 regulados negativamente pelas células da notocorda. A análise IPA identificou 30 moléculas reguladoras dos genes expressos pelas células da notocorda. Destas, o hepatocyte growth fator (HGF) foi identificado como o principal fator de crescimento a montante das células da notocorda ativando genes importantes para a sua função no disco intervertebral. Discussão: Este estudo isolou pela primeira vez células da notocorda humana. Para o realizar foi desenvolvida uma metodologia complexa, cujas aplicações se estendem para lá desta área de investigação. A análise por microarrays identificou marcadores fenotípicos das células da notocorda, alguns dos quais potencialmente responsáveis pelos seus efeitos protetores no disco intervertebral. O fator de crescimento HGF foi identificado como um regulador destas células, podendo ser responsável por algumas das funções que lhes são atribuídas.^len^aIntroduction: For the development of cell-based therapies targeting intervertebral disc (IVD) degeneration a thorough understanding of its cells and the molecular pathways leading to their differentiation is required. The embryonic, foetal and juvenile nucleus pulposus (NP) is populated by large vacuolated notochordal cells that with skeletal maturity become replaced by smaller chondrocyte-like cells. Since animal and in vitro studies have shown that notochordal cells display protective and anabolic roles in the IVD, their loss in humans has often been suggested to initiate the degenerative process. As such, a detailed understanding of these cells and their regulatory pathways may help to identify factors involved in IVD homeostasis and the development of novel cell-based therapies targeting disc degeneration. The study of human notochordal cells has however been hindered by ethical, logistical and technical restrictions in obtaining suitable samples, which constitutes a major limitation to the field. This study was conducted with the objective of isolating notochordal cells (precursors of the NP) from their adjacent sclerotomal tissues (precursors of the annulus fibrosus (AF) and vertebrae) from human embryonic and foetal spines and to identify their phenotype and potential factors involved in their function in the IVD. Methods: Human embryonic and foetal spines (3.5-12 weeks post-conception) were dissected and characterised morphologically to confirm their suitability as sources of notochordal cells. Then, and since there was no visible demarcation between the NP, AF and vertebral regions, a strategy involving the identification of a notochord-specific marker to label and sort notochordal cells was devised. To identify a notochordspecific marker, a literature search was performed followed by the validation of identified putative markers in the human foetal spine using immunohistochemistry. Subsequently, and as the identified marker had an intracellular location, a novel methodology was developed to allow for the extraction of high quality RNA from limited numbers of fixed, permeabilised, labelled with a fluorescent antibody and sorted cells. Using the optimised methodology, RNA was extracted from notochordal and sclerotomal cells. Separation accuracy was validated using real time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) for known notochordal markers. Microarrays were then used to identify differentially expressed genes between notochordal and sclerotomal cells and interactive pathway analysis (IPA) was used to identify notochordal cell regulators. Results: The human foetal spine was validated as a suitable source of notochordal cells. The literature search identified 16 putative markers and the validation of a panel of these identified KRT8, KRT18 and KRT19 as human notochord-specific markers. A methodology involving cell fixation and permeabilisation using 95% ethanol/ 5% acetic acid, followed by incubation with a directly conjugated KRT18 antibody and separation by fluorescence activated cell sorting was found to have no detrimental effect on the RNA quality. This method was therefore used to separate enzymatically obtained human foetal notochordal cells (NP precursors and KRT18-positive) from sclerotomal cells (AF and vertebrae precursors and KRT18-negative). qRT-PCR analysis validated the cell separation methodology by confirming that notochordal cells had higher differential expression of the notochordal markers KRT18, KRT19, brachyury, Galectin 3, CTGF and FOXA2. Array analysis identified 782 upregulated and 678 downregulated genes. IPA analysis identified 30 upstream regulators of notochordal cell genes. Of these, hepatocyte growth factor (HGF) was the top growth factor and was predicted to be activating a number of relevant notochordal genes. Discussion: This study isolated, for the first time, human notochordal cells. To do so, a complex labelling methodology was devised that is applicable to different areas of research. Microarray analysis identified a list of notochordal cell markers, some of which may be important in notochordal cell function within the IVD. Importantly, HGF was identified as an upstream regulator of notochordal cells that may be involved in some of the biological functions attributed to them.

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