ARTIGO

Compostos voláteis de óleos essenciais na inibição do desenvolvimento de Monilinia fructicola in vitro

Volatile compounds of essential oils in inhibition of the development of Monilinia fructicola in vitro

Ediane R. Baseggio^1,*, Clevison Luiz Giacobbo², Leandro Galon¹ & Paola M. Milanesi³

¹ Universidade Federal da Fronteira Sul (UFFS), PPGCTA. Campus Erechim, Rodovia ERS 135, km 72, nº 200, CEP 99700-970, Caixa Postal 764 Erechim – RS, Brasil

² Universidade Federal da Fronteira Sul (UFFS), PPGCTA. Campus Chapecó, Rodovia SC 484, Km 2, Bairro Fronteira Sul, CEP: 89801-001, Chapecó – SC, Brasil

³ Universidade Federal da Fronteira Sul (UFFS). Campus Erechim, Rodovia ERS 135, km 72, nº 200, CEP 99700-970, Caixa Postal 764 Erechim – RS, Brasil

(*E-mail: edianerbaseggio@gmail.com)

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RESUMO

Avaliou-se com este trabalho, o efeito dos compostos voláteis dos óleos essenciais de alho (Allium sativum), arruda (Ruta graveolens), carqueja (Baccharis trimera) e nim (Azadirachta indica) sobre o crescimento miceliar e esporulação de Monilinia fructicola. O fungo foi isolado em meio de cultura BDA (Batata-Dextrose-Ágar) a partir de pêssegos infectados pelo patogénio.  Foi aplicado a dose de 20 μL de cada óleo essencial em papel de filtro esterilizado com 1,5 cm², já fixado com cola quente no centro da tampa da caixa de Petri®. Colocou-se um disco contendo micélio e conídios do patogénio de 0,5 cm de diâmetro no centro da superfície do meio de cultura BDA. Todas as caixas foram vedadas com parafilm e em seguida, incubadas em BOD a 25 ºC e fotoperíodo de 12 h. Após 24 h iniciou-se a medição do crescimento miceliar de M. fructicola, por 7 dias, neste dia foi avaliada a produção de conídios. O óleo essencial de alho libertou compostos voláteis que inibiram totalmente o crescimento miceliar de M. fructicola, o que pode ser observado também na produção de conídios. Os demais óleos não diferiram da testemunha.

Palavras-chave: Prunus persica, Podridão parda, Controle alternativo.

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ABSTRACT

The effect of the volatile compounds of the essential oils of garlic (Allium sativum), rue (Ruta graveolens), carqueja (Baccharis trimera) and neem (Azadirachta indica) on mycelial growth and sporulation of Monilinia fructicola were evaluated. The fungus was isolated in BDA (Potato-Dextrose-Agar) culture medium from peaches infected by the pathogen. The 20 mL dose of each essential oil was applied on 1,5 cm² already fixed with hot glue in the center of the Petri dish lid. A disk containing mycelium and conidia of the 0,5 cm diameter pathogen containing mycelium and conidia of the pathogen was placed in the center of the surface of the BDA culture medium. All boxes were sealed with parafilm and then incubated in BOD at 25 ° C and photoperiod for 12 h. After 24 h the measurement of mycelial growth of M. fructicola was started for 7 days, on this day the production of conidia was evaluated. Garlic essential oil released volatile compounds that totally inhibited M. fructicola mycelial growth, which can also be observed in the production of conidia. The other oils did not differ from the control.

Keywords: Prunus persica, Brown rot, Alternate control.

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INTRODUÇÃO

A podridão parda, causada pelo fungo Monilinia fructicola (G. Wint) Honey (fase teleomórfica), ou Monilia fructicola (G. Wint) Batra (fase anamórfica), é a principal causa de perda económica nos pomares de Prunus. Uma vez atingido o pomar os conídios transportados pelo ar, infectam a superfície de ramos, flores e frutos, por meio do desenvolvimento de tubos germinativos e/ou apressórios (Lee e Bostock, 2006).

A infecção nas plantas de pessegueiro por M. fructicola geralmente acomete os órgãos florais. Quando ocorre nos frutos, causa manchas pardas pequenas e circulares com colonização rápida, principalmente, próximo da maturação, desidratando os frutos que passam a apresentar aspecto mumificado ficando presos às plantas ou caindo no solo (May-De-Mio et al., 2016). Em condições desfavoráveis o fungo permanece latente. Na entre safra, sobre os frutos mumificados formam-se os apotécios, contendo ascos que liberam os ascósporos, responsáveis pela infecção primária (May-De-Mio et al., 2004).

Na maioria das vezes as práticas culturais não são suficientes para suprimir a doença, devido à rápida disseminação. Assim, o controle desta, tem se intensificado por meio de fungicidas, cujo uso em demasia tem sido ineficiente. Além disso, nem sempre esses fungicidas são os recomendados para a cultura (Santos et al., 2006).

Dessa forma a pesquisa de metabolitos de plantas tem se tornado uma alternativa no controle de agentes patogénicos, como por exemplo, os óleos essenciais que substâncias com propriedades fungicidas e/ou fungitóxicas (Lazarotto et al., 2009). Os óleos essenciais, possuem potencial ecológico na substituição de produtos de síntese química, pois prejudicam menos ao ser humano e o meio ambiente, degradação mais rápida e amplo espectro de ação (Ferraz et al., 2008).

Para a utilização dessas substâncias no controle de doenças, são necessários estudos que comprovem a eficiência, com ação fungicida direta, caracterizada pela inibição do crescimento miceliar e germinação de esporos de fitopatogénos (Bettiol & Morandi, 2009). O potencial de plantas como o alho (Allium sativum L.), tem sido bastante elucidado, em função da alicina, substância tóxica formada do complexo de aliinase e aliina, que inativa os micro-organismos fitopatogénicos (Casella et al., 2012). Este efeito inibitório tem sido demonstrado para diversos fungos, desde patogéno de pós-colheita, foliares e de solo (Lavezo et al., 2010; Souza & Soares, 2013).

Outras plantas também estão sendo estudadas, como a arruda (Ruta graveolens L.) devido a presença de metabolitos secundários, como flavonóides (quercitina e rutina), cumarinas (psoraleno e bergapteno), terpenóides (limoneno e pineno) (Kuzovkina et al., 2009). Extratos de arruda apresentaram controle de Colletotrichum gloeosporioides (Celoto et al., 2008), Phomopsis sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., Fusarium solani, Cercospora kikuchii e Colletotrichum sp. (Venturoso et al., 2011).

Além destas plantas, a utilização do óleo e extrato da folha de nim (Azadirachta indica A. Juss), também é utilizado no controle de agentes fitopatogénicos devido seu principal composto a azadiractina, presente principalmente nas sementes, biodegradável e de curta persistência no meio ambiente (Martinez, 2002). A sua composição possui terpenos e flavonóides, compostos com reconhecida atividade antimicrobiana, que atuam na defesa química das plantas contra fungos e bactérias (Castro et al., 2004).

Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica in vitro de compostos voláteis libertados a partir dos óleos essenciais de alho, arruda, carqueja e nim, sobre o patogénio Monilinia fructicola, agente causal da podridão parda em pêssego.

MATERIAL E MÉTODOS

Os ensaios decorreram no Laboratório de Fitopatologia da Universidade Federal da Fronteira Sul (UFFS) – Campus Erechim (RS).

Inicialmente, procedeu-se o isolamento de M. fructicola a partir de pêssegos mumificados, oriundos de pomar comercial localizado do município de Chapecó/SC. Para isso, fragmentos dos frutos foram dispostos em caixas de Petri contendo o meio de cultura batata-dextrose-agar (BDA; Himedia^TM). Em seguida, as caixas foram acondicionadas em incubadora tipo Demanda Bioquímica de Oxigênio (BOD), à temperatura de 25 ± 2 °C e fotoperíodo de 12 h, por 7 dias, ou seja, quando o fungo colonizou toda a superfície do meio de cultura. As caixas contendo o patogéno foram armazenadas sob refrigeração (4 ºC) durante 2 dias.

Para a obtenção dos óleos essenciais foram utilizados, bolbilhos de alho (Allium sativum) adquiridos no mercado e provenientes de lavouras do Rio Grande do Sul; folhas de arruda (Ruta graveolens) cultivada em hortas caseiras, sem aplicação de pesticidas; folhas de carqueja (Baccharis trimera), proveniente de campo nativo; e folhas de nim (Azadirachta indica), colhidas a partir de plantas que não apresentavam floração, durante as primeiras horas do dia. As partes vegetais de todas as plantas em estudo foram submetidas à secagem a 40 °C, até obtenção de peso constante. Os óleos essenciais foram extraídos por hidrodestilação em aparelho Clevenger, conforme metodologia descrita por Pansera et al. (2012), com adaptações.

Para verificar a eficiência dos óleos essenciais sobre o crescimento miceliar de M. fructicola, foi avaliada a dose de 20 μL de cada óleo essencial, sendo aplicados em papel filtro esterilizado (1,5 cm²), já fixado com cola quente na porção central da tampa das caixas de Petri (9,0 cm de diâmetro). Em seguida, um disco de 0,5 cm de diâmetro contendo micélio e conídios do patogénio, com 7 dias de crescimento miceliar, foi colocado no centro da superfície do meio de cultura BDA. Todas as caixas foram seladas com Parafilm^® e, em seguida, foram incubadas em câmara tipo BOD a 25 ± 2 ºC e fotoperíodo de 12 h, durante 7 dias. A avaliação ocorreu diariamente, consistindo em medições, do crescimento miceliar das colónias, com duas medidas diametralmente opostas em centímetros (cm), com auxílio de régua graduada.

A partir das medições calculou-se a taxa de inibição de crescimento miceliar (ICM), conforme fórmula descrita por Hillen et al. (2012):

Ao final dos 7 dias de avaliação verificou-se o potencial dos compostos voláteis de óleos essenciais sobre a inibição da esporulação de M. fructicola. Foi preparado uma suspensão de conídios adicionando-se 20 mL de água destilada esterilizada sobre as colónias de M. fructicola em cada caixa do ensaio, seguida por uma leve fricção sobre o micélio do fungo com alça de Drigalski, de modo a se libertarem as estruturas fúngicas. A suspensão foi filtrada em gaze dupla e, então, adicionou-se 80 mL de água destilada e esterilizada, para completar 100 mL de suspensão nas quais, após homogeneização, retirou-se 10 μL para que o número de conídios mL^-1 fosse quantificado em câmara de Neubauer.

O ensaio foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado, com 4 repetições por tratamento, em esquema fatorial 5 x 7 (óleos essenciais + Testemunha x dias de exposição). No tratamento testemunha o fungo em estudo cresceu em meio de BDA sem aplicação do óleo essencial.

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey (p ≤ 0,05), com auxílio do software estatístico GENES (Cruz, 2001) e, quando a variável quantitativa (dias de exposição) foi significativa, efetuou-se a análise de regressão por meio do software SigmaPlot v. 10.0.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os tratamentos com óleo essencial de alho obtiveram efeito anti-microbiano, inibindo completamente o crescimento miceliar de M. fructicola em meio de cultura BDA, diferindo dos demais tratamentos durante todo o período (Figura 1 e Quadro 1). Os óleos essenciais são constituídos por substâncias que podem apresentar propriedades fungistáticas ou fungicidas (Antunes e Cavaco, 2010). No caso do alho, existem alguns trabalhos que comprovam a eficácia dos compostos presentes no óleo para o controle de Phytophthora cactorum, Cryponectria parasitica e Fusarium circinatum, que incidem sobre plantas da família Myrtaceae (Lee et al., 2008). Segundo El-Moghazy et al. (2017) o óleo de alho aplicado com uma dosagem de 6% inibiu o crescimento de Cephalosporium maydis em 98,35%.

 

 

Em relação aos compostos voláteis presentes no óleo de arruda, pode-se observar que ocorreu o controle de desenvolvimento do fungo nos dois primeiros dias, e entre o terceiro e quinto dia estimulou o crescimento, sendo superior à testemunha, fato que também ocorreu com o óleo de nim no quinto dia, sendo que os compostos voláteis destes óleos como o de carqueja não diferiam da testemunha, que possuía apenas o meio BDA.

Os resultados obtidos nesse trabalho contrariam os de Dias-Arieira et al. (2010), em que o óleo de nim (Azadirachta indica) nas concentrações 1 e 1,5%, adicionado ao meio de cultura BDA, reduziu em 84% o crescimento miceliar de Colletotrichum acutatum. Similarmente, Frias et al. (2014) utilizaram 5000 ppm de óleo essencial de nim por litro de meio de cultura BDA e obtivem a redução do crescimento miceliar em 37,22% para Corynespora cassicola, 46,06% para Fusarium sp. e 69,63% para Colletotrichum gloeosporioides.

Ainda, quanto à inibição da esporulação de M. fructicola, obteve-se resultados semelhantes ao crescimento miceliar (Figura 1). Os compostos voláteis presentes no óleo essencial de alho atuam de forma eficiente, evitando totalmente a esporulação do patogénio. Em contrapartida, os compostos voláteis presentes nos demais óleos essenciais não diferiram da testemunha que possuía apenas meio de cultura BDA (Quadro 2).

 

 

Resultados semelhantes foram observados por Pansera et al. (2012) ao utilizarem óleo essencial de carqueja (Baccharis trimera) nas concentrações de 0,15 e 0,20%. Daronco et al. (2015) ao utilizarem óleo essencial de carqueja na concentração de 20%, observaram a inibição de 39% na incidência de Fusarium sp. em sementes de soja. Porém, a utilização de óleo comercial de nim e óleo de alho 5 e 10% inibiram totalmente o desenvolvimento e esporulação de Fusarium oxysporum (Singh et al., 2017). Enquanto que óleo de nim 4% inibiu totalmente germinação de esporos de Phakopsora euvitis (Fialho et al., 2015). Extrato hidroetanólico de arruda inibiu 90% da germinação de esporos de Colletotrichum gloeosporioides (Celoto et al., 2008).

CONCLUSÃO

Os tratamentos com óleos essenciais de alho são promissores na redução do crescimento miceliar de Monilinia fructicola, sendo que tal ação apresenta especificidade de resposta em função das concentrações e do tempo de avaliação. Esse efeito reflete sobre a produção de conídios do agente patogénico.

 

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AGRADECIMENTO

À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) pela concessão da bolsa de estudo, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e a Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) pelo auxílio financeiro.

 

Recebido/received: 2019.02.22

Aceite/accepted: 2019.06.26