INTRODUÇÃO

Os fungos micorrízicos arbusculares (AMF) e as bactérias promotoras do crescimento vegetal (PGPB) são microrganismos que habitam quase todos os solos, inclusive os solos florestais e de agroecossistemas. Formam simbioses mutualistas com as raízes das plantas, ajudando-as a aumentar a absorção de nutrientes e água, o crescimento e a tolerância ao stress por meio de vários mecanismos, diretos e indiretos (^{Smith & Read, 2008}; ^{Backer et al., 2018}). Por isso mesmo, algumas espécies com efeito cientificamente demonstrado encontram-se comercializadas como biofertilizantes (Backer et al., 2018; ^{Ribeiro, 2021}), e a legislação sobre matérias fertilizantes integra o seu uso, deixando bem claro o tipo de produtos que pode ser classificado como um biofertilizante, devendo ser “um produto cujo princípio ativo são microrganismos vivos, (…) que favorecem a nutrição e, ou, o desenvolvimento das plantas, sem afetar a diversidade biológica do solo e do ambiente” (Decreto-Lei No. 30/2022 e Portaria n.º 185/2022). Existe, de facto, uma diversidade de microrganismos que pode ser utilizada, sendo que a legislação referida já contempla produtos com: (i) bactérias fixadoras de azoto, (ii) bactérias solubilizadoras de fósforo, e (iii) fungos micorrízicos (Portaria n.º 185/2022).

O eucalipto é uma árvore amplamente instalada em Portugal, principalmente a espécie Eucalyptus globulus Labill., utilizada principalmente para produção de madeira para a indústria da produção de pasta e papel (^{Reboredo & Pais, 2014}; ^{Malico & Gonçalves, 2021}). Os povoamentos de eucaliptos são conduzidos em regime de talhadia (com rotações de 10-12 anos), ocupando, atualmente, mais de 844 mil hectares no continente, com rendimentos anuais de madeira que variam entre 6 e 40 m³ ha^-1, dependendo das condições edafoclimáticas locais (ICNF, 2015; Reboredo et al., 2021). De acordo com o 6º Inventário Florestal Nacional (ICNF, 2015), a zona ocupada por eucaliptais representa cerca de 26% da floresta continental, o que corresponde a um incremento sistemático da área ocupada ao longo dos últimos 50 anos.

Embora, no setor agrícola, o uso de biofertilizantes já seja comum, no setor florestal isso ainda não se verifica. Porém, os desafios que o setor florestal encontra, em particular o da produção de eucalipto, são semelhantes aos da agricultura: reduzir o uso de fertilizantes e fitofarmacêuticos de síntese, preservar a fertilidade e a biodiversidade do solo, aumentar a produtividade, e reduzir o stress biótico e abiótico a que os eucaliptos estão sujeitos. Nesse sentido, há todo o interesse em avaliar os contributos que a introdução dos biofertilizantes podem trazer ao setor florestal nacional, e foi com esse enquadramento que foi criado o projeto “Bioma Solo: melhorar a relação solo-planta”, financiado pelo IAPMEI/PRR. Num dos seus objetivos, este projeto pretende avaliar a utilização de biofertilizantes comerciais, fornecidos pela Hubel® Verde: um baseado em fungos micorrízicos (Glomus iranicum) e outro em bactérias solubilizadoras do fósforo (P) do género Pseudomonas, de forma individual e conjunta, na redução do uso de fertilizantes minerais no setor florestal. Por hipótese, a inoculação conjunta destes organismos potenciará os seus efeitos benéficos para a planta, neste caso, o E. globulus, permitindo uma redução da adubação mineral de P, sem perda de produtividade em biomassa e sem registo de impacto negativo nos seus parâmetros fisiológicos.

MATERIAIS E MÉTODOS

Caraterísticas do solo e materiais biológicos

Foi selecionado um solo pobre em P (<10 mg kg^-1, em P₂O₅ extraível, Egner-Rhiem), recolhido na região de Pegões (Concelho do Montijo; 38°39'22.9"N 8°35'37.3"W). Trata-se de um solo pouco ácido (pH=5,7; razão solo:água 1:2,5 m/v), não salino (condutividade elétrica = 0,02 mS cm^-1; razão solo:água 1:2 m/v), com baixo teor em matéria orgânica (0,28%, m/m), e baixo teor noutros nutrientes, e.g., potássio (19 mg kg^-1, em K₂O extraível, Egner-Rhiem).

Relativamente aos biofertilizantes comerciais, foi utilizado um inóculo biológico à base de um fungo micorrízico (Glomus iranicum var. tenuihypharum; MycoUp®, Symborg), formulado num substrato mineral argiloso, com 1,2x10⁴ propágulos/100 mL. Foi feita uma aplicação “à plantação”, preparando uma suspensão em água, e aplicando um volume de suspensão calculado de modo a fornecer 2 g de inóculo por planta/vaso.

Foi também utilizado um inóculo comercial à base de bactérias solubilizadoras de P (Pseudomonas putida 10⁸ u.f.c./mL e Pseudomonas fluorescens 10⁸ u.f.c./mL; u.f.c.: unidades formadoras de colónias; Natiphos®, Native HUBEL). Foi feita uma aplicação “à plantação”, com 4 mL de inóculo por planta/vaso, previamente diluído em água desionizada.

Delineamento experimental

Plantas jovens de eucalipto (com aproximadamente 36 semanas), fornecidas pelos Viveiros Aliança (clone G1202), foram mudadas para vasos de 3,5 L de capacidade, utilizando o solo referido anteriormente. Durante a muda, que ocorreu a 16 de fevereiro de 2023, 12 plantas foram inoculadas com G. iranicum (Gi), 12 plantas com P. putida e P. fluorescens (Pp), e outras 12 plantas foram duplamente inoculadas, (Gi+Pp). As doses de aplicação dos inóculos foram as referidas anteriormente, tendo-se utilizado 12 plantas como controlo - não inoculadas (Cont). As plantas foram colocadas a 70% da capacidade de retenção de água do solo, fornecendo metade da água no dia da inoculação, metade no dia seguinte, e mantidas com esse nível de água no solo com rega ocasional por controle do peso, em estufa, no Instituto Superior de Agronomia.

Uma semana após a muda e inoculação, as plantas foram fertilizadas com a mesma dose de N e K, e com doses diferenciadas de P (100, 70 e 40% da dose habitual de P, por via mineral, considerando as caraterísticas do solo, pobre em P). Para isso, todas as plantas receberam 47,14 g de um adubo de libertação controlada (N:P:K 14:11:9), sendo essa a dose mais baixa de P que foi fornecida (40% de P; 5,2 g P₂O₅/planta). Nos tratamentos com doses superiores de P (70 e 100%), ela foi suplementada por aplicação de superfosfato 18% (3,9 e 7,8 g P₂O₅/planta, respetivamente, para o tratamento 70% e 100 %).

Decorridas 7 semanas após o início do ensaio, as plantas foram mudadas para vasos de 50 L de capacidade, utilizando o mesmo tipo de solo, e foram colocadas no exterior. A rega ocasional foi mantida, a partir daí sem controle de peso.

Parâmetros fisiológicos e de crescimento da planta

Periodicamente, foram registados vários parâmetros de desempenho da planta, relacionados com o seu crescimento: a altura, o diâmetro do caule, o número de ramos e de folhas. Foram medidas as taxas de assimilação de CO₂ (A) a transpiração foliar (E) e a condutância estomática (gs) usando o analisador de gases por absorção de radiação infravermelha (CIRAS-3 - PP_systems, USA). O índice relativo de clorofila foi determinado com o sensor CL-01 Chlorophyll Meter da Hansatech Instruments Ltd e o índice fotoquímico de refletância- PRI, e o índice de diferença normalizada da vegetação-NDVI (PlantPen PRI 200, PlantPEN NDVI 300) foram também registados.

Tratamento estatístico dos resultados

Os resultados foram analisados utilizando estatística descritiva (cálculo de média e desvio padrão) e submetidos a uma ANOVA a três vias, para avaliar as diferenças estatísticas entre os resultados e a interação entre as variáveis independentes testadas (Micorriza × Bactéria × dose de fertilizante fosfatado). Sempre que se observaram diferenças significativas nos resultados de um parâmetro (p ≤ 0,05), foi utilizado um Teste de Tukey HSD para evidenciar as diferenças entre as médias (p<0,05). Todas as análises foram realizadas com o STATISTICA 7.0 (Software™ Inc., PA, EUA, 2004).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados preliminares que se apresentam foram registados 10 semanas após o início do ensaio, já com as plantas no exterior (Figura 1). De uma forma geral, não foram visíveis respostas diferenciadas no crescimento dos eucaliptos, mesmo nos tratamentos em que a adubação fosfatada foi reduzida a 40% da aplicada no controlo.

Figura 1 (A) Panorâmica das 48 plantas utilizadas no ensaio, em vasos de 50 L, às 10 semanas de crescimento; e (B) pormenor de uma das plantas. 

A aplicação das bactérias solubilizadoras de fósforo, Pp, foi o único tratamento com um efeito significativo no índice relativo de clorofila (p<0,05), sendo este estatisticamente superior nas plantas inoculadas com a bactéria (Quadro 1), embora esse mesmo efeito não tivesse sido observável nos valores do índice de diferença normalizada da vegetação - NDVI, que também são proporcionais aos teores de clorofila da planta. Outros autores encontraram efeitos benéficos da inoculação com PGPB no teor de clorofila de plantas (^{Efthimiadou et al., 2020}). Por outro lado, a inoculação com AMF teve um efeito significativo no número de folhas nas plantas (p<0,05) (Quadro 1), sendo as plantas inoculadas com fungo AMF, com e sem bactérias, as que apresentaram, tendencialmente, um menor número de folhas por planta (Quadro 1). Embora os resultados, entre si, não tenham apresentado diferenças significativas (teste de Tukey, p>0,05), esta tendência evidenciada pela análise de variância pode ser explicada pelo facto de a simbiose com AMF ter um custo de carbono para a planta, necessário para a manutenção das estruturas micorrízicas, principalmente nas fases iniciais do estabelecimento da simbiose (^{Mortimer et al., 2005}). No entanto, quando a simbiose fica operativa, esta redução no crescimento é compensada, observando-se um aumento do crescimento das plantas micorrizadas (^{Manga et al., 2022}).

Não se verificou nenhum tipo de interação entre os tratamentos (Gi, Pp e dose de fertilizante fosfatado) nas variáveis observadas (índice relativo de clorofila e número de folhas), pelo menos não no tempo de duração do ensaio, nem diferenças significativas entre as médias registadas nesta fase do crescimento (10 semanas; teste de Tukey, p>0,05). No entanto, uma vez que a absorção de P por parte da planta continuará, não se pode ainda descartar a hipótese de, em fases mais avançadas do ensaio, o efeito da fertilização ser mais evidente, especialmente nos tratamentos com as doses menores de P.

Situações de stress, hídrico ou outras, podem levar a uma diminuição nos valores da condutância estomática (gs) e, de uma forma geral, nas trocas gasosas na planta, avaliadas também através da medição da taxa de assimilação de CO₂ (A) e transpiração foliar (E). Tal não se verificou no tempo de duração do ensaio (Quadro 2), na generalidade dos tratamentos, sem diferenças significativas entre tratamentos, por comparação com o controlo, não inoculado. Sabendo que estes parâmetros são indicadores de stresses ou situações de senescência a que a planta possa estar sujeita (^{Navarro-Torre et al., 2023}), a ausência de diferenças significativas entre os tratamentos e doses de fertilizante, relativamente a estes parâmetros, é um bom indicador de que os eucaliptos não se encontravam em stress no tempo decorrido após o início do ensaio. Há a registar, no caso da condutância estomática, uma interação significativa entre os tratamentos (Gi, Pp e dose de fertilizante fosfatado; p<0,05), o que indica que os parâmetros se influenciam mutuamente (Quadro 2). No intervalo de tempo que durou o ensaio, a aplicação conjunta de bactérias e fungos micorrízicos permitiu um aumento das trocas gasosas na planta, mesmo com doses reduzidas de adubação fosfatada, o que não se verificou nas situações de inoculação simples.

No final de primeiro ano de crescimento, será realizado um controle da colonização micorrízica, essencial para que se possa aferir se a aplicação de inóculo de G. iranicum foi eficaz para o estabelecimento de uma simbiose com as raízes do eucalipto, e serão também realizadas análises físico-químicas e bioquímicas ao solo e à planta.

CONCLUSÕES

Os inoculantes avaliados são promissores, uma vez que, em apenas 10 semanas de crescimento, já se verificaram efeitos significativos dos microrganismos utilizados no crescimento (número de folhas) do eucalipto e no índice de clorofila. Os próximos meses de crescimento serão essenciais para validar essa avaliação, uma vez que, em situação de escassez nutricional de P, será expectável que os eucaliptos inoculados possam ter uma melhor capacidade de enfrentar essa escassez.