INTRODUCCIÓN

Las malas hierbas son el principal problema fitosanitario del cultivo del arroz, causando pérdidas cercanas al 30% de la producción (^{Calha et al., 2023}). El control se hace principalmente mediante el uso de herbicidas. En la actualidad, la mayoría de los herbicidas autorizados para el cultivo del arroz pertenecen a dos modos de acción: inhibidores de la acetolactato sintasa (ALS) y de la acetil coenzimaA-carboxilasa (ACCasa). El uso de herbicidas con el mismo modo de acción junto con la falta de uso de otras herramientas de control, han producido un incremento en la aparición de poblaciones de malas hierbas resistentes.

Hay confirmados varios casos de malas hierbas resistentes a herbicidas en las diferentes zonas arroceras españolas en las principales malas hierbas de arroz: Echinochloa spp., Leptochloa spp., Cyperus difformis y Alisma plantago-aquatica (Gómez de Barreda et al., 2022) a herbicidas inhibidores de la ALS y de la ACCasa. Como resultado de esta resistencia, así como de una disminución significativa en el número de nuevos herbicidas y una regulación cada vez más estricta del uso de herbicidas, especialmente en Europa es necesaria la implementación de una gestión integrada de las malas hierbas, donde se minimice el número de tratamientos herbicidas y se maximice su eficacia, integrando alternativas de control no químico.

Benzobiciclon es un herbicida con un nuevo modo de acción herbicida en el cultivo del arroz. Pertenece al grupo de inhibidores de la 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD) (grupo 27) que actúa sobre una amplia gama de malas hierbas en arrozales. La tolerancia del arroz a dicho herbicida puede variar en función de la genética de cada cultivar. El gen HPPD Inhibitor Sensitive 1 (HIS1) es el responsable de la tolerancia en el arroz, que se confiere a través de la hidroxilación del hidrolizado de benzobiciclón (herbicida activo) en un compuesto menos fitotóxico que no es benzobiciclón (pro-herbicida) (^{Maeda et al., 2019}). La sensibilidad en ciertos cultivares es el resultado de una deleción de 28-bp que da lugar a una proteína truncada (Maeda et al., 2019) o de una mutación sin sentido (T1510G) que codifica para una glicina en lugar de una valina en el aminoácido 286 (Val-286-Gly) (^{Lv et al., 2021}). En lo sucesivo, un alelo HIS1 con cualquiera de las mutaciones se denominará his1.

El arroz salvaje es una de las malas hierbas más problemáticas del cultivo del arroz. Los productores actualmente dependen en gran medida de la tecnología de arroz resistente a herbicidas para su control (por ejemplo, Clearfield^® y Provisia^®) (^{Peñas et al., 2022}). El herbicida benzobiciclón ha demostrado cierto potencial para ser una pieza complementaria para el programa de control de arroz salvaje, tanto en arroz convencional como en arroz resistente a herbicidas (^{Patterson et al., 2022}). El éxito de benzobiciclón para controlar el arroz salvaje en un campo concreto dependerá en gran medida de la frecuencia de alelos HIS1/his1 de la accesión (^{Brabham et al., 2022}).

El objetivo principal de este trabajo ha sido el genotipado el gen HIS1, para detectar la presencia de diferentes cambios en dicho gen relacionados con la sensibilidad al herbicida (presencia de alelo his1) en diferentes accesiones de arroz salvaje recogidas en diferentes zonas arroceras de Extremadura.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Para este estudio se analizaron 30 accesiones de arroz salvaje procedentes de distintos campos de cultivo de Extremadura y recolectada en diferentes años (Tabla1).

Extracción/cuantificación de ADN

El ADN se extrajo de semillas de arroz salvaje utilizando el kit Speedtools Plant DNA Extraction Kit (Biotools B&M Labs S.A., Valle de Tobalina, Madrid, España). La concentración de cada muestra se midió en un espectrofotómetro NANODROP Thermoscientific (ThermoFisher, Nano-Drop Products, Wilmington, DE).

Amplificación por PCR

Se utilizaron tres conjuntos de cebadores para amplificar diferentes regiones del gen HIS1 donde se pueden producir cambios relacionados con la tolerancia al herbicida, como se indicó en la introducción: deleción de 28 pb (^{Maeda et al., 2019}) y mutación T1510G (^{Lv et al., 2021}). Además, tomando como referencia ^{Brabham et al. (2020}), se amplifico la región donde diferentes cambios nucleótidicos se corresponderían a genotipos HIS1/HIS1 (TGATGC), HIS1/his1 (T/CGATGC/T) e his1/his1 (CGATGT). Los primers utilizados, así como las condiciones de amplificación por PCR están descritos en los artículos citados anteriormente.

Secuenciación del gen

El producto de amplificación de la PCR se visualizó bajo luz ultravioleta (320 nm; instrumento ALPHA DIGI DOC Pro, Alpha Innotec Corporation, Johannesburgo, Sudáfrica). A continuación, se purificaron las bandas de cada PCR utilizando el Speed Tools PCR Clean-Up Kit (Biotools, B&M Labs, Madrid, España). Las muestras se secuenciaron en un laboratorio externo (STABVIDA, Caparica, Portugal). Los resultados de la secuenciación se visualizaron con el software CHROMAS y se alinearon con los resultados de la PCR.

RESULTADOS

Deleción 28 bp

La deleción de 28 pares de bases descrita en ^{Maeda et al. 2019} no fue encontrada en ninguna de las accesiones de arroz salvaje incluidas en este estudio (datos no mostrados).

Genotipado HIS1/his1 (región TGATGC)

Como se mencionó en la metodología, se amplificó la región donde diferentes cambios nucleótidicos se corresponderían a genotipos HIS1/HIS1 (TGATGC), HIS1/his1 (T/CGATGC/T) e his1/his1 (CGATGT). De las 30 accesiones incluidas en este estudio, 4 presentaron el genotipo his1/his1, 2 el genotipo HIS1/his y los 24 restantes el genotipo HIS1/HIS1 (Figuras 1A y 1B).

Figura 1 (A) Alineamiento de secuencias de diferentes accesiones de arroz salvaje (región TGATGC); (B) Cromatogramas correspondientes a genotipos HIS1/HIS1 (TGATGC), HIS1/his1 (T/CGATGC/T) e his1/his1 (CGATGT). 

Mutación puntual (T1510G)

De las 30 accesiones analizadas, solo una muestra (AS-1902) ha presentado la mutación T1510G descrita en ^{Lv et al. (2021}) como responsable de la tolerancia a benzobiciclón (Figura 2). Esta muestra también presenta un genotipo HIS1/his, como se describió en el apartado anterior.

Figura 2 Alineamiento de secuencias de diferentes accesiones de arroz salvaje (región T1510G). 

CONCLUSIONES

Tanto la mutación T1510G como la deleción de 28 pb están relacionados directamente con la sensibilidad al herbicida benzobiciclón en los cultivares de arroz que la presentan (^{Lv et al., 2021}). El genotipado en base a lo publicado por ^{Brabham et al. (2020}) puede dar ciertos errores en la correcta identificación de los accesiones sensibles-tolerantes a benzobiciclón. Experimentos realizados en nuestro laboratorio han mostrado que la presencia del genotipo his1/his1 o HIS1/his1 está relacionado con un blanqueamiento inicial de la planta tratada, que desaparece con el tiempo, y la sensibilidad viene dada cuando aparece asociado a alguna de las otras dos mutaciones (Osuna, comunicación personal).

De las 30 accesiones incluidas en este estudio, solo una de ellas presenta la mutación T1510G, y seis de ellas han sido genotipadas como his1/his1 o HIS1/his1. Se está ampliando este estudio con la inclusión de más accesiones, pero como conclusión preliminar se podría decir que el benzobiciclón puede proporcionar cierto grado de supresión en plantas, proporcionando un control complementario a los utilizados en la actualidad.