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INTRODUCCIÓN
Uno de los aspectos que debe tener en cuenta el proceso de evaluación del posible impacto ambiental asociado a la comercialización de cultivos genéticamente modificados (GM) en la Unión Europea (UE) es el riesgo de cruce de estos cultivos con sus especies silvestres, lo que puede dar lugar al flujo de los transgenes a especies emparentadas. Casi la totalidad de la superficie de maíz transgénico que se cultiva en Europa está localizada en España, que alberga el 96% del único evento aprobado para su cultivo en la UE (Areal & Riesgo, 2022), el maíz Bt MON810 resistente a insectos. Este maíz expresa la toxina Cry1Ab para el control de las plagas Sesamia nonagrioides y Ostrinia nubilalis, denominadas taladros del maíz. La aparición de teosinte, ancestro silvestre del maíz, en campos de cultivo de maíz localizados en el valle del Ebro (Pardo et al., 2014) donde se concentra la mayor superficie de maíz Bt en España (MAGRAMA, 2023), además de ser un riesgo agrícola al competir con el cultivo causando pérdidas económicas, podría suponer un riesgo ambiental puesto que el maíz puede hibridar espontáneamente con la mayoría de sus parientes silvestres de teosinte (Andersson & de Vicente, 2010). Esta hibridación podría dar lugar a una introgresión de los transgenes en la especie silvestre, y conferir a ésta características que le favoreciese en su proliferación y persistencia. En el caso del cruzamiento entre teosinte y maíz Bt, los híbridos generados expresan la toxina Cry1Ab (Arias-Martín et al., 2022).
En este trabajo se plantean tres objetivos: a) determinar el potencial de hibridación entre teosinte localizado en España y maíz Bt y, en híbridos obtenidos, b) realizar un seguimiento fenológico de las etapas vegetativa y reproductiva y, c) cuantificar la producción de toxina Cry1Ab, puesto que una producción de toxina en concentraciones subletales para las plagas diana, podría contribuir a una aceleración en el desarrollo de resistencia a los cultivos Bt, principal riesgo para el éxito de esta herramienta de control.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se utilizaron las variedades de maíz (Zea mays ssp. mays L.) DKC6451YG que expresa toxina Cry1Ab de Bacillus thuringiensis (maíz Bt, evento MON810). Las semillas de teosinte (Tz) que infestaba campos de maíz de Zaragoza (Aragón) fueron proporcionadas por el Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA).
Cruzamientos teosinte ♀ x maíz Bt ♂ e identificación de los híbridos F 1
Durante 2019, 2020 y 2021 se realizaron cruzamientos por polinización libre en condiciones de competencia de polen para obtener híbridos F1 entre teosinte y maíz Bt. Las siembras se realizaron el 29 de abril 2019, 5 de mayo 2020 y 13 de mayo 2021 en macetas de 30 cm de diámetro, ubicadas en el exterior de las instalaciones del INIA (40º 27´ N; 3º 45´O). El crecimiento de las plantas y el protocolo para la realización de los cruzamientos se describe en Arias-Martín et al. (2019). Las semillas recogidas en las plantas de teosinte se desinfectaron con Domestos® (7%) durante 10 minutos, se aclararon con agua tres veces y se sembraron en cámara en condiciones controladas (25:20 ºC y 16:8 h día/noche). Cuando las plántulas se encontraban en 2-3 hojas, se identificaron los híbridos por la detección de la toxina Cry1Ab mediante ELISA (AgraStrip® Cry1Ab Seed and Leaf). El número de híbridos obtenidos se multiplicó por dos debido a que el parental maíz era heterocigótico para la producción de toxina. Se calculó la hibridación como la razón entre el nº de híbridos y el nº de semillas germinadas, en porcentaje. Se calculó la hibridación mínima estimada, puesto que puede haber híbridos que no germinen, como la razón entre el nº de híbridos y el total de semillas analizadas, en porcentaje.
Fenología de híbridos y parentales
El 13 y el 10 de mayo de 2022 y 2023, respectivamente, se realizaron las siembras de los parentales. Los híbridos F1 se trasplantaron entre 10 y 15 días después cada año tras su identificación. El cultivo de las plantas se realizó en las condiciones descritas en el apartado anterior. El crecimiento vegetativo (VE) se midió una vez por semana durante 6 semanas después de la emergencia. Se analizó la altura, área del tallo entre las hojas 3 y 4, número de hojas y número de tallos secundarios. Durante la fase reproductiva se contabilizó el nº de días hasta la aparición del penacho (VT) y de estigmas (R1). La duración de VE, VT y R1 se expresó en unidades de tiempo térmico, calculando los grados-día de crecimiento (GDD) con límites de temperatura máxima (Tmáx) y mínima (Tmín) de 30°C y 10°C respectivamente, siguiendo la ecuación GDD30,10=[(Tmín + Tmáx)/2]-Tb, donde la temperatura base (Tb) fue de 10°C, acumulándose entre cada estado.
Cuantificación de la toxina Cry1Ab
Cuando las plantas de maíz descritas en el apartado anterior se encontraban en el estadio V8-V11, se tomó una muestra (8-13 mg) de la parte central de las hojas 6, 7 y 8, analizando un mínimo de 5 plantas por año y generación. La cuantificación se hizo por duplicado mediante DAS ELISA, con el kit de Agdia Bt-Cry1Ab/Cry1Ac (Elkhart, EEUU). La muestra se homogeneizó con 500 µl tampón fosfato-salino-Tween 20 durante 3 ciclos 30´ a 4.000 rpm de (BeadBlaster 24R) y se centrifugó 5´´a 12.000 rpm. Las concentraciones de la curva de calibración fueron: 0,125; 0,5; 1; 3; 6; 9; 12; 15; 18 y 21 ng de proteína Cry1Ab purificada/ml. Se tomaron medidas espectrofotométricas en lector SpectroStar Nano (BMG Labtech, Alemania) a 650 nm.
Análisis estadístico
Se analizaron las diferencias en los parámetros fenológicos de la fase vegetativa entre los parentales y los híbridos F1 (Tz x Bt) con un Modelo Lineal Multivariante (MLM). El factor fijo fue la generación y como covariable se utilizó los GDD acumulados. La deteción de diferencias significativas en la concentración de toxina Cry1Ab entre el maíz Bt y los híbridos F1 (Tz x Bt) se realizó mediante una Modelo Lineal Mixto analizando los factores genotipo (fijo), año (aletorio) y su interacción. Se utilizó el software SPSS (IBM©SPSS© Estadística, V29, 2022).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Hibridación
Los resultados de los experimentos realizados durante tres años se muestran en la Tabla 1. Sólo se identificaron híbridos en los cruzamientos del año 2022. De 5 plantas analizadas se obtuvieron híbridos en 4. Del total de 450 semillas puestas a germinar en 2022 germinaron el 63,8 %. El porcentaje de hibridación entre teosinte y maíz calculado en base al número de semillas germinadas varió entre el 28,6 % y el 72,2 % entre plantas, con un valor medio del 37,9 ± 26,5%. Cuando el porcentaje de hibridación se calculó en relación al número total de semillas analizadas, la hibridación mínima estimada fue del 21,3 ± 13,4 % (20 - 35,6 %). Para los tres años, de 15 plantas analizadas se obtuvo una tasa media de hibridación del 12,6 % entre teosinte y maíz.
Tabla 1 Hibridación entre maíz y teosinte introducido en España. La hibridación (media ± DE) se calcula en relación a semillas germinadas. La hibridación mínima estimada, en relación a semillas analizadas
| Año | Plantas | Nº semillas (semillas/planta) | Nº Semillas analizadas | Germinación (%) | Nº híbridos detectados (estimados) | Plantas con híbridos (%) | Hibridación mínima estimada (%) | Hibridación (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 2019 | 5 | 391 (78 ± 63) | 391 | 36,1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2021 | 5 | 515 (103 ± 71) | 411 | 17,0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2022 | 5 | 1287 (257 ± 136) | 450 | 63,8 | 49 (98) | 80 | 21,3 ± 13,4 | 37,9 ± 26,5 |
| Total | 15 | 7,1 ± 12,3 | 12,6 ± 21,8 |
Otros estudios en condiciones controladas han descrito la dificultad para la obtención de híbridos entre el teosinte introducido en España y el maíz (Tritkova et al., 2017; Lohn et al., 2021). En condiciones de no-competencia de polen Lohn et al. (2021) obtuvieron para el mismo sentido del cruzamiento porcentajes de hibridación del 2,7 % (0 -11 % entre plantas) entre el teosinte español y otra variedad de maíz Bt. En nuestro caso, a pesar de no obtener híbridos en 2 de los 3 años de experimentos, en el año en el que este tuvo éxito los porcentajes de hibridación fueron superiores a los reportados en ausencia de competencia. Las condiciones de realización de los cruzamientos pueden influir en el éxito de los mismos. Además, análisis genómicos han determinado que el genotipo del teosinte encontrado en España es de origen mixto, con Z. m. ssp. mexicana, Z. m. ssp. parviglumis y una variedad cultivada de maíz no identificada (Díaz et al., 2020), lo que podría explicar la heterogeneidad encontrada en los cruzamientos, ya que ambas subespecies presentan diferentes tasas de hibridación con maíz (Ellstrand et al., 2007; Arias-Martin et al., 2019).
Fenología
El factor año no fue significativo para los parámetros evaluados, pero se encontraron diferencias significativas entre genotipos. Los híbridos presentaron una mayor altura y las hojas emergieron antes que en ambos parentales, mientras que el área de su tallo era igual al del maíz. El número de tallos secundarios fue mayor en el teosinte (Tabla 2). Los parámetros evaluados indican que los híbridos, más altos, con tallos más gruesos y más frondosos que el parental teosinte, podrían verse favorecidos y tener un mayor nivel de competencia con el cultivo, si bien probablemente el menor número de tallos secundarios influiría en su producción de semilla en relación con el teosinte.
Tabla 2 Altura, área del tallo, número de hojas y tallos secundarios (media marginal ± DE), de los parentales e híbridos analizadas una vez por semana durante 6 semanas desde la emergencia durante dos años. Letras diferentes indican diferencias significativas (MLM, Bonferroni, p<0.05)
| Generación | Altura (cm) | Área del tallo (cm2) | Nºhojas | Nº Tallos secundarios |
|---|---|---|---|---|
| Maíz Bt | 62,3 ± 1,7 a | 2,3 ± 0,1 b | 9,2 ± 0,2 a | 0,1 ± 0,2 a |
| Teosinte Tz | 60,5 ± 1,6 a | 1,7 ± 0,1 a | 9,3 ± 0,2 a | 2,6 ± 0,2 c |
| F1 (Tz x Bt) | 79,3 ± 1,7 b | 2,3 ± 0,1 b | 10,4± 0,2 b | 1,4 ± 0,3 b |
| F (P) | 39,69 (<0,00) | 12,81 (<0,00) | 14,77 (<0,00) | 34,49 (<0,00) |
En relación a la etapa reproductiva, las plantas se comportaron de forma similar en los dos años estudiados (Figura 1). La aparición de inflorescencias masculinas en el teosinte, tuvo lugar a principos y mediados de agosto y las femeninas a finales de ese mismo mes. Alguna planta floreció en septiembre. En el caso del maíz y los híbridos, la fase reproductiva se inició un mes antes (de mediados a finales de julio).
Figura 1 Grados-día de crecimiento (GDD) hasta VE (
), VT (
), y R1 en el 50% de las plantas (
) de los parentales e híbridos para cada año. Entre paréntesis se indica el número de plantas evaluadas.
Cuantificación de toxina Cry1Ab
La concentración de toxina en las plantas de maíz Bt fue de 46,8 ± 10,0 y 51,4 ± 2,7 ng Cry1Ab/mg de hoja fresca en los años 2022 y 2023, respectivamente. En las plantas F1 varió entre 48,8 ± 11,3 y 36,4 ± 8,8 ng Cry1Ab/mg de hoja fresca para esos mismos años. El análisis estadístico muestra que la interación entre los factores año y genotipo es significativa (F1,84 = 16,14; P =0,001), lo que indica que la relación entre la producción de toxina Cry1Ab en cada genotipo puede depender de las condiciones ambientales en las que se desarrollan la plantas, como ha sido descrito por Trtikova et al. (2015). Estas concentraciones de toxina parecen encontrarse dentro de los niveles necesarios para el control de las plagas (Lohn et al., 2021), y en trabajos futuros se realizarán bioensayos para determinar su actividad.
CONCLUSIONES
El teosinte introducido en España hibrida de forma espontánea con el maíz Bt. Los híbridos forman semilla viable, que da lugar a plantas que pueden ser más vigorosas que sus parentales. En estos híbridos, se acorta el tiempo necesario hasta alcanzar la fase reproductiva, lo que facilitaría su cruzamiento con el maíz al favorecerse la sincronía en la floración. Los híbridos producen toxina Cry1Ab en niveles similares al maíz Bt. La concentración de toxina varía en función de las condiciones ambientales.
