1. Síndrome das deleções múltiplas do mtDNA

As doenças mitocondriais associadas à presença de deleções múltiplas do mtDNA ocorrem mais frequentemente em adultos e podem apresentar, na sua maioria, uma hereditariedade autossómica recessiva ou dominante, sendo esta última mais frequente.¹⁰ O tamanho das diferentes deleções do mtDNA é variável, até mesmo em doentes da mesma família. O espetro mutacional desta síndrome tem vindo a aumentar devido à descoberta de cada vez mais genes associados à instabilidade do mtDNA. Seguidamente será efetuada uma breve descrição das principais manifestações clínicas e asetiologias moleculares associadas.

i) Peo (Oftalmoplegia externa progressiva autossómica dominante ou recessiva)

As características clínicas mais comuns da PEO no adulto incluem a fraqueza dos músculos oculares externos, ptose bilateral, fraqueza muscular proximal e intolerância ao exercício. Sintomas como a presença de cataratas, perda de audição, neuropatia axonal sensorial, ataxia, depressão, hipogonadismo, e parkinsonismo também podem ocorrer. Características menos comuns incluem prolapso da válvula mitral, miocardiopatia e alterações da motilidade gastrointestinal. Os indivíduos afetados apresentam deleções múltiplas ao nível do mtDNA que se encontram exclusivamente nos tecidos musculares.

Mutações nos genes POLG, POLG2, C10orf2, SLC25A4, TK2, RRM2B, DGUOK, MGME1 OPA1 e MFN2, encontram-se associados a PEO podendo apresentar uma hereditariedade autossómica recessiva ou dominante sendo a forma autossómica recessiva geralmente mais grave.^10,11

Seguidamente são referidos os principais genes envolvidos na etiologia molecular de PEO associados à síndrome das deleções múltiplas.

POLG: a mitocôndria contêm uma única DNA polimerase, a polimerase gama (POlγ), imprescindível desde muito cedo na embriogénese.¹² A POlγ é codificada pelo nDNA sendo a única polimerase exclusivamente responsável pela replicação e reparação do mtDNA e essencial na sua manutenção. Esta enzima é composta por uma subunidade catalítica, POlγA, que possui atividade de polimerase e de exonuclease, sendo codificada pelo gene POLG; e uma subunidade acessória, POlγB, que potencia a ação da enzima.¹³ A POlγ juntamente com o mtDNA, a helicase do mtDNA e as diversas proteínas de ligação formam o complexo de replicação funcionante.¹⁴

As mutações que se encontram no gene POLG são uma das principais causas da doença mitocondrial podendo estar associadas a uma grande variedade de sintomas clínicos, para além de PEO, tais como: parkinsonismo, síndrome de Alpers -Huttenlocher, encefalomiopatia neurogastrointestinal mitocondrial (MNGIE), neuropatia ataxia sensorial disartria e oftalmoparesia (SANDO) e ataxia espinocerebelar e epilepsia (SCAE).^15,16,17

Este gene está localizado no cromossoma 15 e é composto por 23 exões que se estendem ao longo de 18,55 Kb. Apesar de ter sido identificado em 1996¹⁸, somente em 2001 foi descrita a primeira mutação patogénica.¹⁹ Até à data, mais de 200 mutações foram publicadas, das quais 65 foram descritas associadas a PEO, sendo este gene um hot-spot para mutações em doenças mitocondriais (human gene mutation Database-HGMD, POLG database).²⁰ Mutações no POLG podem também ser associadas à forma hepatocerebral da síndrome da depleção do mtDNA.¹⁵

Mutações neste gene podem apresentar uma hereditariedade autossómica recessiva ou autossómica dominante ou até a mesma mutação pode apresentar ambos os padrões de hereditariedade.^21,22

POLG2: a POlγB, subunidade acessória da POl?, codificada pelo gene POLG2, aumenta a eficiência da enzima. Alterações nesta subunidade podem causar deleções múltiplas do mtDNA.

O gene POLG2, localizado no cromossoma 17, é composto por oito exões que se distribuem ao longo de 19,28 Kb. A primeira mutação patogénica foi descrita em 2006 associada à forma autossómica dominante de PEO.²³ posteriormente mais 12 mutações foram descritas neste gene associadas a fenótipos mitocondriais inespecíficos (HGMD).

C10orf2 (Twinkle): a helicase/primase mitocondrial codificada pelo gene C10orf2 também é responsável pela forma autossómica dominante de PEO.²⁴ mutações neste gene estão associadas a apresentações clínicas que podem apresentar PEO ‘’puro’’, ou uma forma mais complexa de PEO associada a fraqueza muscular proximal dos membros e músculos faciais, disfagia e disfonia, ataxia, e neuropatia periférica.

O gene C10orf2 está localizado no cromossoma 10, sendo composto por 5 exões ao longo de 6,38 kb. A primeira mutação patogénica, associada a PEO, foi descrita em 2001²⁴ e desde então mais de 40 mutações patogénicas foram publicadas (HGMD). Algumas mutações neste gene foram também identificadas na forma hepatocerebral da síndrome da depleção do mtDNA.^25,26

SLC25A4 (ANT1): este gene codifica o transportador mitocondrial de adenina específico do músculo cardíaco (ANT1). A proteína ANT1 é a proteína mitocondrial mais abundante e, no seu estado funcional, é um homodímero de subunidades de 30 kD incorporados assimetricamente na membrana mitocondrial interna. O homodímero forma um poro através do qual o ADP é transportado da matriz para o citoplasma. Nos mamíferos podem distinguir-se quatro isoformas específicas em diferentes tecidos.

O gene SLC25A4 está localizado no cromossoma 4 e possui 4 exões distribuídos ao longo de 4,04 Kb. A primeira mutação patogénica foi descrita em 2000²⁷ e, desde então, apenas nove mutações estão referenciadas. Destas, cinco estão associadas à forma autossómica dominante de PEO, três estão associadas a miopatia e a miocardiopatia hipertrófica e uma foi identificada num doente com SANDO.

MGME1: o gene MGME1 foi recentemente descrito²⁸ e localiza-se no cromossoma 20. É composto por quatro exões e codifica uma exonuclease mitocondrial que é essencial para uma síntese eficaz do mtDNA. É a primeira exonuclease mitocondrial identificada a estar envolvida na replicação do mtDNA, podendo ter uma função adicional de reparação, através do reposicionamento da cadeia de DNA ou das estruturas de DNA-rNA durante a síntese do mtDNA.

Encontram-se descritas duas mutações em três famílias distintas com PEO, que apresentam perda de peso acentuada e insuficiência respiratória.²⁸ As biópsias musculares destes doentes revelaram quer deleções múltiplas, quer depleção do mtDNA.

ii) SANDO (NeuropatIa, ataxia sensorIal, disartria e oftalmoparesia)

SANDO é uma doença sistémica, autossómica recessiva, caracterizada principalmente pelo aparecimento de neuropatia, ataxia sensorial, disartria e oftalmoparésia em adultos. O fenótipo é muito variável, mesmo dentro da mesma família, e pode ainda incluir miopatia, convulsões e perda de audição.²⁹ Até à data, foram descritas 14 mutações no gene POLG associadas a este fenótipo (HGMD).¹⁶

iii) SCAE (Epilepsia e ataxia espinocerebelar)

SCAE é uma patologia semelhante a SANDO mas com uma maior frequência de enxaquecas e convulsões.³⁰ Estão descritas quatro mutações no gene C10orf2 e uma no gene POLG associadas a esta doença.

iv) MNGIE (Encefalomiopatia neurogastrointestinal mitocondrial)

MNGIE é uma doença autossómica recessiva com início entre a segunda e quinta décadas de vida caracterizada clinicamente por PEO, (pseudo) dismotilidade gastrointestinal, caquexia, leucoencefalopatia difusa, neuropatia periférica e morte precoce. Ao nível do mtDNA podem ser observadas deleções múltiplas e/ou depleção do mtDNA.³¹ mutações nos genes TYMP e RRM2B e mais recentemente no gene POLG³² foram relacionadas com este fenótipo. Seguidamente é referido o principal gene envolvido na etiologia molecular de MNGIE.

TYMP (ECGF1): o gene TYMP codifica a enzima timidina fosforilase (TP), que está envolvida no catabolismo das pirimidinas. Défices da enzima tp levam a uma acumulação sistémica de timidina e deoxiuridina, o que leva a um desequilíbrio da pool de deoxinucleótidos e consequentemente a uma instabilidade do mtDNA, originando o aparecimento quer de deleções múltiplas quer de depleção do mtDNA.³³

O gene TYMP está localizado no cromossoma 22 e é composto por 10 exões que se estendem ao longo de 4,3 kb. As primeiras mutações patogénicas foram descritas por Nishino e colaboradores³³ e, desde então, 80 mutações associadas a este fenótipo foram publicadas neste gene.

2. Síndrome da depleção do mtDNA

A síndrome da depleção do mtDNA caracteriza-se por uma redução acentuada do número de cópias do mtDNA em relação às do nDNA, associada muitas vezes a um défice múltiplo dos complexos enzimáticos da cadeia respiratória mitocondrial. Este grupo de doenças raras e devastadoras manifesta-se maioritariamente logo após o nascimento, causando a morte prematura de muitos doentes durante a infância ou início da adolescência. Esta síndrome é transmitida de modo autossómico recessivo e pode apresentar-se sob três formas: miopática, encefalomiopática e hepatocerebral. Embora a maioria destas manifestações ocorram em tecidos específicos, afetando fundamentalmente o fígado, o músculo ou o cérebro, outros tecidos podem também ficar comprometidos na evolução da doença.³⁴ O seu mecanismo fisiopatológico está fundamentalmente relacionado com a manutenção da pool de nucleótidos mitocondriais, que assume um papel crucial na replicação e integridade do mtDNA.

A depleção do mtDNA (número de cópias do mtDNA inferior a 35%) nos tecidos afetados, con-firma o diagnóstico clínico desta síndrome.

Seguidamente é efetuada uma breve descrição das principais formas da síndrome de depleção do mtDNA, assim como dos genes envolvidos na sua etiologia molecular.

i) Forma hepatocerebral

A forma hepatocerebral é a apresentação mais comum desta síndrome. Os primeiros sintomas ocorrem entre o nascimento e os 6 meses de vida e incluem vómitos persistentes, atraso de crescimento, hipotonia e hipoglicemia. A nível histológico pode-se encontrar esteatose microvacuolar, colestase, fibrose e cirrose. Estes doentes têm normalmente uma morte precoce, durante o primeiro ano de vida.Uma apresentação peculiar da forma hepatocerebral é a síndromede Alpers-Huttenlocher, caracterizada por falência hepática, convulsões, evoluindo para epilepsia parcial contínua e deterioração neurológica global. O uso de ácido valpróico como tratamento para a epilepsia pode precipitar a falência hepática aguda. Mutações no gene POLG são uma causa frequente desta síndrome. Até ao momento, estão descritas cerca de 55 mutações associadas à forma hepatocerebral, distribuídas pelos seguintes genes: DGUOK, MPV17, POLG, C10orf2, TK2 e SUCLG1. Genes, como DGUOK e MPV17, encontram-se também associados à síndrome das deleções múltiplas do mtDNA.^35,36 Uma breve descrição destes genes será efetuada seguidamente, com exceção dos genes POLG e C10orf2, que foram descritos na secção anterior e dos genes TK2 e SUCLG1que serão descritos posteriormente nas formas miopática e encefalomiopática desta síndrome, respetivamente.

DGUOK: a cínase deoxiguanosina (DGUOK) fosforila a deoxiguanosina e a deoxiadenosina, contribuindo para a síntese de dois nucleótidos necessários à manutenção da pool de desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs) mitocondrial.^22,37 A associação da síndrome da depleção do mtDNA com mutações neste gene sugere que a manutenção desta pool de dNTPs representa um papel crucial na replicação e integridade do mtDNA e consequentemente no seu conteúdo. Os doentes com mutações no gene DGUOK, localizado no locus 2p13, apresentam geralmente alterações hepáticas progressivas e dificuldades alimentares, associadas a disfunção neurológica (hipotonia, nistagmus e atraso psicomotor) por volta dos primeiros meses de vida. A presença de neuropatia periférica e tubulopatia são raras mas, foram descritas ocasionalmente.³⁸ mutações neste gene causam depleção do mtDNA fundamentalmente no fígado, e mais raramente no músculo e nos fibroblastos. As primeiras mutações patogénicas descritas neste gene foram publicadas em 2001 por Mandel e colaboradores.³⁹ Atualmente, foram descritas mais de 50 mutações em cerca de 100 doentes (HGMD).

MPV17: outro gene envolvido nesta forma clínica é o MPV17 que se localiza no locus 2p23-p21 e codifica uma pequena proteína da membrana mitocondrial interna de função ainda pouco esclarecida. Estima-se que participa na manutenção da pool de dNTPs necessária para a síntese de mtDNA. O seu papel na patogénese e desta síndrome é ainda desconhecido. Clinicamente estes doentes apresentam falência hepática grave, hipoglicemia, sintomas neurológicos e múltiplas lesões a nível cerebral durante o primeiro ano de vida.⁴⁰ A presença de depleção do mtDNA no fígado e/ou no músculo, assim como um défice múltiplo dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial, estão normalmente presentes nestes doentes. Foram descritos aproximadamente 30 indivíduos com mutações no gene MPV17.^41,42 Desde a identificação da primeira mutação neste gene⁴³, foram descritas mais de 25 mutações associadas a esta forma clínica e também à neuro-hepatopatia de Navajo, uma doença multissistémica autossómica recessiva encontrada na comunidade de Navajo no sudoeste dos Estados Unidos.²²

ii) Forma miopática

Na forma miopática da síndrome da depleção do mtDNA, o aparecimento de sintomas ocorre normalmente no primeiro ano de vida, com dificuldades alimentares, atraso de crescimento, hipotonia e fraqueza muscular. A creatina cínase está frequentemente aumentada, sendo um marcador importante para o diagnóstico, uma vez que não é muito comum em doentes com outras miopatias mitocondriais.⁹ A morte destes doentes ocorre normalmente nos primeiros anos de vida devido a insuficiência pulmonar e infeções, mas existem casos que sobreviveram até à adolescência.⁴⁴ Estas manifestações clínicas e bioquímicas são acompanhadas de sinais morfológicos típicos de miopatia mitocondrial tal como a presença de fibras citocromo c oxidase negativas. A proliferação de mitocôndrias sob a forma de fibras rotas e vermelhas não é uma característica primária consistente mas, no entanto, pode aparecer mais tarde no decorrer da doença.

TK2: a timidina cínase (TK2) é uma enzima que fosforila a deoxitimidina, deoxicitosina e deoxiuridina, participando juntamente com a DGUOK na síntese de nucleótidos necessários para a manutenção da pool de dNTPs mitocondrial.⁴⁵

O gene TK2 localiza-se no locus 16q22 e as mutações descritas neste gene estão especificamente associadas à forma miopática. Os sintomas aparecem durante a infância ou a adolescência e caracterizam-se por miopatia progressiva, culminando em falência respiratória e em morte, nos casos mais graves. No entanto, os fenótipos menos graves apresentam uma evolução mais lenta da doença e um maior tempo de sobrevivência.³⁴

Em 2001, Saada e colaboradores⁴⁶ identificaram pela primeira vez mutações neste gene. Depois desta primeira observação, um total de 37 mutações no TK2 foram já descritas em mais de 50 doentes.⁴² A maioria destas mutações estão associadas à forma miopática. No entanto, existem mutações associadas a outros fenótipos, como é o caso da PEO, surdez neurosensorial e encefalomipatia com epilepsia (HGMD).

iii) Forma encefalomiopática

Em 2005, Elpeleg e colaboradores⁴⁷, descreveram uma forma de encefalomiopatia autossómica recessiva associada a depleção do mtDNA. O aparecimento dos sintomas ocorre igualmente na infância e manifesta-se através de hipotonia muscular, atraso psicomotor grave, deterioração neurológica progressiva, surdez, perda de movimentos voluntários, oftalmoplegia externa, convulsões generalizadas e disfunção tubular renal. Verifica-se um aumento do lactato sanguíneo e na ressonância magnética cerebral, podem-se observar lesões nos gânglios basais sugestivas da síndrome de leigh.³⁷

Mutações nos genes, RRM2B, SUCLA2 e SUCLG1 estão associadas a esta forma de apresentação clínica, sendo estes seguidamente descritos.

RRM2B: o gene RRM2B localiza-se no locus8q23 e codifica a subunidade R2 da redutase ribonucleotídica (RNR), uma enzima citosólica que está envolvida no passo terminal da síntese de novo dos dNTPs, convertendo os nucleótidos em dNTPs durante a interfase do ciclo celular (fase S). A RNR está também envolvida no suplemento de dNTPs durante a reparação do DNA. Mutações neste gene estão associadas a hipotonia, acidose láctica, atraso de desenvolvimento e tubulopatia. A doença apresenta uma evolução rápida e fatal e manifesta-se frequentemente nos primeiros meses de vida. Laboratorialmente é identificada uma diminuição acentuada do número de cópias de mtDNA no músculo destes doentes.

Em 2007, Bourdon e colaboradores⁴⁸ descreveram a primeira mutação patogénica neste gene, estando atualmente mais de 30 mutações descritas em aproximadamente 15 doentes.⁴²

SUCLA2 e SUCLG1: a enzima succinil-coA sintetase catalisa a síntese reversível do succinato e ATP a partir de succinil-coA e ADP no ciclo dos ácidos tricarboxílicos (TCA). Esta enzima é constituída por duas subunidades, a e ß, codificadas pelos genes SUCLG1 (2p11) e SUCLA2 (13q12), respetivamente. Mutações nestes genes parecem dificultar a associação entrea succinil-coA sintetase e a cínasedifosfato nucleósido, resultando num desequilíbrio na pool de dNTPs mitocondrial e consequentemente na depleção do mtDNA no músculo.⁴⁹ Um dado importante para a suspeita do envolvimento destes genes é a presença de uma excreção urinária, moderada a elevada, de ácido metilmalónico e a presença de intermediários do TCA. Clinicamente revelam hipotonia muscular proeminente, atraso psicomotor grave, distonia progressiva, surdez e convulsões generalizadas. Os doentes com mutações no gene SUCLG1 podem ainda apresentar dismorfias pré-natais, crises metabólicas neonatais e a morte pode ocorrer nos primeiros meses de vida.

Estão descritos cerca de 30 doentes com mutações nestes genes, das quais nove no SUCLA2⁵⁰ e 13 no SUCLG1 (HGMD).

Abordagens de diagnóstico das doenças de comunicação intergenómica

Nas doenças da comunicação intergenómica, a apresentação clínica pode variar entre as síndromes bem definidas e os fenótipos multissistémicos inespecíficos, onde o envolvimento neurológico está geralmente presente. Estabelecer um diagnóstico preciso num doente com suspeita de patologia mitocondrial revela-se um desafio, que requer uma abordagem multidisciplinar a nível clínico, bioquímico e histopatológico, para além de uma história familiar bem documentada. Os dados bioquímicos, tais como aumento de lactato e piruvato, quer no plasma, no LCR ou na urina, alteração do perfil de ácidos orgânicos, aumento da alanina no perfil dos aminoácidos plasmáticos, assim como os dados de ressonância/tomografia cerebral são indicadores importantes para o diagnóstico destas patologias. A determinação da atividade enzimática dos complexos enzimáticos da cadeia respiratória mitocondrial é importante para orientar a abordagem molecular, em particular em doentes sem fenótipo específico. Como o mtDNA codifica subunidades de vários complexos da fosforilação oxidativa (CI, CIII, CIV e CV), é expetável que uma depleção do mtDNA provoque um défice combinado da fosforilação oxidativa (com exceção do CII, o único não codificado pelo mtDNA). No entanto a atividade enzimática dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial no músculo pode ser normal, se o tecido muscular não se encontrar entre os tecidos afetados, como acontece nos doentes com formas hepatocerebrais da síndrome da depleção do mtDNA.

A análise por southern-blot ou por PCR quantitativo em tempo real identifica simultaneamente as deleções múltiplas e a depleção do mtDNA. Independentemente da tecnologia aplicada utiliza-se um gene nuclear de referência específico para a análise (18s) sendo muito importante o uso de controlos da mesma idade e do mesmo tecido, dada a natureza dinâmica da qualidade e quantidade do mtDNA.⁵¹ considera-se como cut-off para o diagnóstico de depleção do mtDNA um número de cópias de mtDNA inferior a 35% em relação aos indivíduos controlo, podendo este número atingir valores mais baixos nos casos mais graves.

Considerações finais

As citopatias mitocondriais não dispõem de terapia eficaz,àexceção dosdéfices primários de ubiquinona (CoQ10) que respondem clinicamente à suplementação com CoQ10, embora sejam muito raros. Em geral, o tratamento efetuado nestas doenças é meramente sintomático e paliativo, usando-se cocktails vitamínicos, cofatores e eventualmente creatina e carnitina.

A investigação em termos de diagnóstico neste grupo de patologias não é muito diferente da que se aplica noutras doenças e inclui a recolha de dados como história familiar, exame físico incluindo o neurológico, exames laboratoriais de rotina e específico se eventual realização de biópsia muscular para estudo histopatológico, bioquímico e molecular.⁵² Uma doença mitocondrial que se manifesta ao nascimento ou nos primeiros dias de vida é mais provável estar associada com alterações a nível do nDNA do que com alterações a nível do mtDNA. As síndromes da depleção e das deleções múltiplas do mtDNA têm surgido cada vez mais como uma das principais causas de um amplo espetro de patologias multissistémicas de início na infância ou na idade adulta, respetivamente. Os avanços recentes na tecnologia de sequenciação, nomeadamente a utilização da sequenciação de nova geração, permitiram esclarecer a etiologia molecular em 55% dos doentes com suspeita de patologia mitocondrial, possibilitando a identificação de mutações causais em novos genes, por vezes não diretamente relacionados com patologias mitocondriais.^53,54,55

A caraterização molecular destes doentes é importante não só para permitir a realização de aconselhamento genético e diagnóstico pré-natal adequados, nos casos em que forem identificadas mutações no nDNA, mas também para melhorar a compreensão da fisiopatologia da doença. Uma estratégia de diagnóstico precisa e focada irá economizar recursos e possibilitará avanços consideráveis no conhecimento destas patologias.

Agradecimentos

Lígia S Almeida tem financiamento da Fundação para a Ciência e Tecnologia ao abrigo do Programa Ciência 2008 (FCTC2008/INSA/ P4). Célia Nogueira teve financiamento da Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/45247/2008).

Referências