Amostragem

Utilizou-se miolo de amêndoa proveniente de uma mistura comercial de variedades de casca mole fornecido por uma empresa de Alfândega da Fé (Portugal). Posteriormente, esse miolo de amêndoa foi levado para o laboratório e realizados os ensaios de conservação.

Ensaios de conservação

As condições de armazenamento testadas foram três humidades relativas (60, 70 e 80%), à temperatura de 25 °C, durante 0, 30 e 60 dias. Para obter cada humidade relativa foram preparadas diferentes soluções saturadas de sais, nomeadamente: para a de 60% usou-se brometo de sódio (NaBr); para a de 70% o iodeto de potássio (KI) e para a de 80% o cloreto de amónio (NH₄Cl) (^{Greenspan, 1977}), que foram colocadas em frascos fechados, juntamente com o miolo de amêndoa. A cada tempo foram retiradas três amostras de fruto, de cada humidade relativa, para proceder à sua caracterização físico-química e microbiológica. Para realizar algumas análises, tais como a proteína e gordura, as amostras foram previamente liofilizadas (Scanvac, Coolsafe, Lynge, Dinamarca).

Atividade da água (a _w ) e cor

A a_w foi determinada num medidor de atividade da água portátil (Novasina, LabSwift-aw, Lachen, Suíça). A cor foi avaliada através de um colorímetro Minolta CR-400 (Konica Minolta Company, Japão), expressando-se os resultados no sistema CIELAB, no qual o L* avalia a luminosidade e varia entre 0 (preto) e 100 (branco), a coordenada colorimétrica a* varia entre o verde (valores negativos) e o vermelho (valores positivos), enquanto a coordenada colorimétrica b* varia entre o azul (valores negativos) e o amarelo (valores positivos). As coordenadas cilíndricas da cor, tonalidade (h*) e croma ou saturação (C*), também foram determinadas. As análises foram realizadas em 10 frutos.

Teores de humidade, proteína e gordura

Os teores de humidade, proteína e gordura de cada amostra foram determinados utilizando procedimentos AOAC (AOAC, 1995) e expressos em g/100g de matéria fresca (m.f.). O teor de humidade foi determinado secando a amostra até peso constante a 105 °C. O teor de proteína nas amostras foi estimado pelo método Kjeldahl, com um fator de conversão de 5,18, conforme ^{Yada et al. (2013}). A gordura total foi determinada por extração em Soxhlet, de uma massa conhecida de amostra, com éter de petróleo durante 16h. Todos os ensaios foram feitos em triplicado.

Estabilidade oxidativa

A estabilidade à oxidação foi determinada no miolo e no óleo de amêndoa (tendo o último sido extraído pela metodologia descrita anteriormente), segundo o método da condutividade avaliado no equipamento Rancimat 743 (Metrohm, Suíça). As amostras (3 g para o óleo e 0,5 g para o fruto) foram aquecidas a 120 ± 1,6 ºC. Os resultados foram expressos em tempo de indução (h). As análises foram feitas em triplicado.

Espectrofotometria no ultravioleta (UV)

A análise por espectrofotometria no ultravioleta pode fornecer indicações sobre a qualidade do óleo da amêndoa. A análise da absorvância no ultravioleta foi efetuada segundo o descrito no Regulamento de Execução (UE) 2015/1833 (UE, 2015), seguindo a seguinte metodologia: aproximadamente 0,6 g de toma de amostra foram dissolvidas em 10 mL de iso-octano (2,2,4-trimetilpentano), determinando-se em seguida, em cuvetes de quartzo de percurso ótico de 1 cm, o coeficiente de extinção da solução, nos comprimentos de onda indicados no regulamento, designadamente 232 e 268 nm, em relação ao iso-octano no seu estado puro. As leituras de absorvância foram efetuadas num espectrofotómetro UV/Visível (Genesys™ 10, Portugal). Os coeficientes de extinção a 232 e 268 nm foram calculados de acordo com as seguintes equações:

Em que c corresponde à concentração da solução inicial; A₂₃₂ ao valor de absorvância a 232 nm; e A₂₆₈ ao valor de absorvância a 268 nm.

Análises microbiológicas

As amostras ao longo do período de armazenamento foram avaliadas em relação à qualidade microbiológica. Após pesagem de 10 g de miolo de amêndoa e posterior homogeneização com água peptonada estéril realizaram-se diluições decimais apropriadas, seguido de plaqueamento, em duplicado, de uma alíquota de 0,2 mL nos meios de cultura: Plate count agar (PCA, Liofilchem, Itália), para a quantificação de microrganismos a 30 ºC, e Dichloran Glycerol (DG18, Liofilchem, Itália) agar, para a quantificação de bolores e leveduras. As placas foram incubadas a 30 ºC durante 46-72 h (PCA) e a 25 ºC durante 5 dias (DG 18). Os resultados obtidos foram expressos em unidades formadoras de colónias por grama (UFC/g).

Análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL), versão 18.0. Para as propriedades físico-químicas e microbiológicas das amêndoas, a normalidade e a homogeneidade da variância foram sempre verificadas pelos testes Shapiro-Wilk e Levene, respetivamente. Quando foi observada normalidade e homogeneidade de variâncias, aplicou-se uma ANOVA, seguida do test post-hoc de Tukey. Pelo contrário, quando ambas as condições falharam, foi aplicado o teste não-paramétrico de Kruskall-Wallis, seguido da comparação múltipla das médias das ordens.

Aspeto visual e cor

Na Figura 1 apresentam-se as fotografias das amêndoas ao longo do armazenamento e submetidas a diferentes humidades relativas. Durante o armazenamento, verificou-se que as amêndoas peladas não apresentaram alterações visíveis na sua aparência visual, sugerindo que as diferentes humidades relativas aplicadas não interferiram no aspeto visual deste fruto seco. Em relação aos parâmetros de cor, verificaram-se poucas alterações significativas, ao longo do armazenamento, o que está de encontro com a Figura 1. Quando se compara a mesma humidade relativa ao longo do período de armazenamento (0, 30 e 60 dias), verificou-se que apenas se detetaram diferenças significativas no parâmetro L* na humidade relativa de 80%, tendo este parâmetro aumentado.

Figura 1 Aspeto visual e parâmetros da cor do miolo sem película, ao longo do armazenamento realizado a diferentes humidades relativas. 

Atividade de água (a _w ), teores de humidade, proteína e gordura

O Quadro 1 apresenta a a_w e os teores de humidade, gordura e proteína das amostras armazenadas a diferentes humidades relativas, à temperatura de 25 (C. Ao analisar o Quadro 1 verificou-se a não existência de diferenças significativas para cada HR ao longo do armazenamento (0, 30 e 60 dias), para os teores de humidade, proteína e gordura. Ao comparar HRs entre si, as únicas diferenças significativas foram detetadas para o teor de humidade após 30 dias (menor valor para 60%) e para a proteína após 60 dias (menor valor para 70%). Em relação à atividade da água, os menores valores foram observados para a HR de 60%, após 30 (0,624±0,007) e 60 dias (0,595±0,006), ao contrário da HR de 80%, para a qual não se observaram diferenças significativas ao longo do tempo de armazenamento. Além disso, observou-se que após 2 meses, as amostras armazenadas a 60% de HR apresentaram valores inferiores a 0,6 (valor em que a maioria dos microrganismos não se desenvolve).

Estabilidade oxidativa e parâmetros da análise espectrofotométrica no UV

No processo de deterioração oxidativa há um período inicial, chamado período de indução, o qual, quanto maior for, mais estável será o óleo. Geralmente, com o aumento do tempo de armazenamento, o período de indução tende a diminuir. No presente estudo verificou-se que, salvo raras exceções, os tempos de indução não variaram significativamente ao longo do armazenamento, tanto no miolo como para o óleo (Quadro 2). Apenas foram verificadas diferenças significativas para a HR de 70% para o fruto, como para a HR de 60% para o óleo ao longo do armazenamento. Até aos 60 dias de armazenamento, a HR não teve um efeito significativo na estabilidade oxidativa, quando se compararam as HRs entre si para cada um dos tempos de armazenamento.

No Quadro 3 estão representados os resultados obtidos na análise de espectrofotometria por UV do óleo extraído das amêndoas, durante o armazenamento. No que se refere aos valores de K₂₃₂, verificou-se que houve uma diminuição ao longo do tempo de armazenamento para as três HRs estudadas, ou seja, houve uma redução dos compostos primários da oxidação (^{Kiralan e Bayrak, 2013}) (hidroperóxidos e dienos conjugados) (^{Laguerre et al., 2007}). Já pelo contrário, houve um aumento nos valores de K₂₆₈ ao longo do armazenamento, indicativo da formação de um maior número de compostos da oxidação secundária. No entanto, só se verificaram diferenças significativas entre o início do armazenamento e os 60 dias de armazenamento para as HRs de 60 e 80%. Ao comparar as diferentes HRs, verificou-se que no final do armazenamento, não existiram diferenças significativas em nenhum parâmetro. Apesar de não haver nenhum documento legal que estabeleça os valores máximos dos parâmetros obtidos por espectrofotometria por UV do óleo extraído das amêndoas, verificou-se que o presente óleo apresenta valores de K₂₆₈ ≤ 0,22, dentro do limite estabelecido para azeite virgem para este parâmetro (Regulamento de Execução (UE) 2019/1604 da Comissão de 27 de setembro de 2019 (UE, 2019)). Pelo contrário, para o K₂₃₂, os valores obtidos foram superiores ao estabelecido para o azeite virgem extra (≤ 2,50) (Regulamento de Execução (UE) 2019/1604 da Comissão de 27 de setembro de 2019 (UE, 2019)). No entanto, quando se comparam os valores obtidos para o óleo de amêndoa com um óleo alimentar comercial (K₂₃₂= 9.205, K₂₆₈ = 1.370) (^{Ventura, 2014}), verificou-se que o óleo do presente trabalho apresenta valores inferiores para todos os parâmetros obtidos por espectrofotometria por UV.

Análises microbiológicas

Quanto à contagem de microrganismos presentes nas amostras sujeitas a diferentes HRs, é possível verificar que não houve um aumento da população de microrganismos a 30 ºC, bem como de bolores e leveduras, durante o período de armazenamento (Quadro 4). De facto, verificou-se uma diminuição significativa na contagem de microrganismos a 30 °C após 60 dias, em relação ao início. Em relação aos bolores e leveduras, apesar de se observar também uma diminuição desses microrganismos durante o armazenamento, as diferenças não foram significativas. Devido ao facto da a_w ser baixa (0,6-0,7), os microrganismos presentes são possivelmente fungos xerófilos, uma vez que alguns destes fungos podem germinar ou até crescer a a_w tão baixas como 0,7 (^{Gock et al., 2003}). Quando se estuda o efeito da HR no crescimento microbiano, verificou-se que até aos 2 meses de armazenamento não se observou qualquer efeito, visto que não se detetaram diferenças estatísticas entre amostras submetidas a diferentes HRs para um tempo específico (letras minúsculas por coluna). Assim, pode-se afirmar que o tempo de armazenamento afetou a carga microbiana, ao contrário da HR, ao considerar 60 dias de armazenamento.

Tendo em conta, os resultados microbiológicos obtidos durante o ensaio podemos concluir que as amêndoas armazenadas a diferentes HRs apresentaram uma qualidade microbiológica satisfatória, de acordo com os limites estabelecidos para a contagem de microrganismos a 30 °C pela FCD (2016) e ^{Gilbert et al. (2000}) (<10⁴ e <10⁵ UFC/g, respetivamente), e para os bolores e leveduras por ^{Witthuhn et al. (2005}) e FCD (2016), (<10³ e <5×10³ UFC/g, respectivamente), para o grupo de frutos secos.