Evaluation of two rootstock grapevine in vitro introduced in a culture medium contend aluminum

Stefan Lucius Burkhardt¹; Fabíola Villa²; Aparecido Lima da Silva³; Moacir Pasqual⁴.

¹Departamento de Agricultura (DAG), Universidade Federal de Lavras (UFLA), Lavras, MG, Brasil. Caixa Postal 3037, CEP: 37200-000.

E-mail: fvilla2003@libero.it, mpasqual@ufla.br

(Manuscrito recebido em 14.05.09 . Aceite para publicação em 05.11.09)

RESUMO

A toxidez de alumínio é o fator limitante de maior importância para a produtividade das culturas no mundo. Neste sentido, este trabalho busca determinar um método de avaliação do comportamento de 2 porta-enxertos de videira (Paulsen 1103 e Gravesac), em condições estressantes de alumínio in vitro. Após a desinfestação, os explantes foram inoculados em tubos de ensaio contendo 15 mL de meio de cultura DSD1. As culturas in vitro foram transferidas para salas de crescimento e mantidas sob condições de temperatura de 25°C, fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 40-45 μmol.m^-2.s^-1. Após a autoclavagem do meio de cultivo, as doses de alumínio foram adicionadas ao meio de cultura em câmara de fluxo laminar e os valores de pH corrigidos para 4,0. Foram implantados dois experimentos. No primeiro, os explantes dos dois porta-enxertos foram colocados diretamente no meio de cultura DSD1 líquido com diferentes concentrações de Al, onde ficaram por um período de 60 dias até a avaliação. No segundo experimento, os explantes foram introduzidos em mesmo meio, na ausência de alumínio. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado composto por seis frascos, contendo três plantas cada um, num total de sete tratamentos. Verificaram-se comportamentos distintos entre as variedades, com relação às concentrações de Al. Ocorreu correlação negativa entre atividades de Al⁺³ e produção de biomassa. A partição de carbono entre as variedades foi alterada pelas diferentes concentrações de alumínio.

SUMMARY

The aluminum toxicity is the limiting factor of larger importance for the productivity of cultures in the world. In this sense, this work search to determine a method of evaluation of the behavior of 2 rootstock grapevine (Paulsen 1103 and Gravesac), in aluminum stressful conditions in vitro. After the disinfestations, the explants were inoculated in tubes containing 15 mL of culture medium DSD1. The cultures in vitro were transferred for growth rooms and maintained under temperature conditions of 25°C, photoperiod of 16 hours and luminous intensity of 40-45 μmol.m^-2.s^-1. After the sterilization of culture medium, the doses of aluminum were added to the culture medium in camera and the pH values corrected for 4.0. Two experiments were implanted. In the first, the explants of two rootstock were placed directly in the DSD1 liquid with different Al concentrations, where were maintained for 60 days until the evaluation. In the second experiment, the explants were introduced in same culture medium, in the absence of aluminum. The experimental delineate was blocks, with six flasks containing three plants each one, in a total of seven treatments. Different behaviors were verified among the varieties, with relationship to aluminum concentrations. It was a negative correlation between activities of Al⁺³ and biomass production. The partition of carbon among the varieties was altered by the different aluminum concentrations.

Keywords: toxicity, Vitis spp., culture medium DSD1, tissue culture.

INTRODUÇÃO

O alumínio é o metal mais abundante e o terceiro elemento mais comum na crosta terrestre, compreendendo aproximadamente 7% da sua massa total, e em solos ácidos, sua toxicidez é o fator limitante de maior importância para a produtividade das culturas no mundo (Hartwig et al., 2007). Os sintomas da toxicidez por alumínio em vegetais muitas vezes não são facilmente identificados. O sintoma mais expressivo e típico da toxicidez por alumínio, indicador do estresse, ocorre na raiz que é o principal órgão afetado e tem o seu crescimento inibido (Delhaize e Ryan, 1995).

Na viticultura catarinense verificou-se, a partir de 1985, uma acentuada queda de produtividade dos vinhedos e uma redução da área plantada, o que representava cerca de 30% da área total. Entre várias causas, estavam fatores nutricionais relacionados às características dos solos (Cordeiro, 2006).

A partir de 1998/99, verifica-se uma reversão do quadro pessimista que dominava o setor vitivinícola catarinense, com a expansão da área plantada. Para o plantio e a renovação dos vinhedos catarinenses existe uma grande demanda de mudas, principalmente de qualidade genética e sanitária comprovada (Desplobins e Silva, 2005). Portanto, o emprego de genótipos adaptados às condições de solo ácido conjuntamente com a adição de calcário e adubações racionais, são estratégias de maior potencial para a utilização racional dos solos com elevados teores de alumínio trocável (Kochian et al., 2005).

Assim, este trabalho buscou determinar um método de avaliação do comportamento de porta-enxertos de videira, Paulsen 1103 e Gravesac, em condições estressantes de alumínio in vitro.

MATERIAL E MÉTODOS

Os porta-enxertos Paulsen 1103 (Vitis rupestris x Vitis berlandieri) e Gravesac [161-49 (Vitis riparia x Vitis berlandieri) x 3309C (Vitis riparia x Vitis rupestris)] foram provenientes da Estação Experimental de Videira (EPAGRI), Videira (SC) e Fazenda Experimental de Caldas (EPAMIG), Caldas (MG), respectivamente, sendo variedades introduzidas no Brasil (Alvarenga et al., 2002).

As plantas matrizes foram mantidas em casa de vegetação, em condições controladas contra patógenos, e submetidas à fertirrigação com solução nutritiva para videira (Pouget, 1984). Para seleção dos explantes, desinfestação, introdução e manutenção in vitro foram utilizadas metodologias de cultura de tecidos para a videira (Galzy, 1985). Após a desinfestação, os explantes foram inoculados em tubos de ensaio contendo 15mL de meio de cultura DSD1 (Silva e Doazan, 1995).

As culturas in vitro foram transferidas para salas de crescimento e mantidas sob temperatura de 25°C, fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 0,040-0,045 mM.m^-2.s^-1. A sustentação dos explantes no meio líquido foi obtida por intermédio da utilização de segmentos de cortiça previamente preparados e esterilizados.

Os tratamentos com alumínio (Al) foram definidos com base nos seguintes critérios: considerando-se que a concentração final de Al na solução é fortemente dependente do pH, adotou-se o valor 4,0 como padrão. Outro aspecto observado foi a concentração total de alumínio encontrada naturalmente nos solos ácidos (0-0,35mM), podendo em casos especiais, atingir 1mM (Adams e Moore, 1983). Para corrigir as "concentrações" termodinâmicas denominadas de atividades, foi utilizado o programa GEOCHEM-PC v.2.0 (Parker et al., 1987), ficando, então os tratamentos (concentrações de alumínio), conforme mostra o Quadro I .

Os explantes foram introduzidos em meio DSD1 líquido sem a presença de Al. Após 30 dias em crescimento in vitro, as plantas foram selecionadas pelo tamanho (plantas médias) e submetidas aos diferentes tratamentos, onde aguardaram por mais 30 dias até a fase de avaliação.

Os valores de área foliar foram determinados a partir de imagens obtidas por digitalização e analisadas com auxílio do programa IDRISI. Desta forma foram avaliadas variáveis relacionadas ao sistema radicular (número de raízes, peso seco), parte aérea (área foliar, peso seco foliar e peso seco total), e combinações entre elas. Para a avaliação do pH nos diferentes tratamentos, retiraram-se alíquotas de 0,5 mL (em ambiente de câmara de fluxo laminar) de cada frasco referente aos tratamentos, perfazendo uma amostra composta com volume final de 3,0 mL. O pH foi medido em intervalo médio de 5 dias, ao longo de trinta dias.

Para todos os experimentos o delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualisado. Para as avaliações morfológicas dos porta-enxertos foram utilizadas seis repetições de plantas in vitro. Os experimentos com estresse de íon Al⁺³ foram compostos por seis vidros, contendo três plantas cada um, num total de sete tratamentos (Quadro I).

Quando da introdução das plantas nos tratamentos, elas já apresentavam, tanto a parte aérea quanto o sistema radicular formados, aspecto pelo qual os diferentes tratamentos não poderiam ter influenciado no número de raízes primárias. Quanto ao número de raízes secundárias, a variedade Gravesac se mostrou altamente influenciada pelas diferentes concentrações de alumínio (Figuras 1A e 1B).

Verificou-se que as menores concentrações de alumínio promoveram uma pequena redução do número de raízes secundárias, observado até a concentração de 0,425mM. Em concentrações superiores a 0,425mM de alumínio ocorreu um crescimento no número de raízes secundárias até atingir o máximo próximo da concentração de 1,2mM. Também foi observado o aparecimento de pontuações, com tonalidades marrons e/ou negras, indicando a tentativa de emissão de primórdios radiculares, mas devido o efeito da alta toxicidade no meio não apresentou a capacidade de regenerar novas raízes.

QUADRO I

Concentração total de alumínio (Al), concentração de Al+3 livre e atividade do Al+3 na solução DSD1 a pH = 4,0 (Software GEOCHEM PC versão 2.0).

Aluminum total concentration (Al), Al+3 free-concentration and Al+3 activity in DSD1 solution with pH = 4,0 (Software GEOCHEM-PC

version 2.0).

Verifica-se na literatura que a toxicidez por alumínio provoca o aumento do número de raízes secundárias (Dantas et al., 2001). Provavelmente o efeito fitotóxico do alumínio promova a destruição das células meristemáticas da raiz alterando a produção de hormônios que controlam o crescimento da parte apical (Hartwig et al., 2007), quebrando a dominância da raiz principal e induzindo a ramificação de raízes secundárias.

Fig. 1A - Relação de n° de raízes secundárias em função das concentrações de Al (mM) na var. Gravesac in vitro. Relation of secondary roots number in function of Al concentratios (mM) in var. Gravesac in vitro.

Fig. 1B - Relação de n° de raízes totais em função das concentrações de Al (mM) na var. Gravesac in vitro. Relation of total roots number in function of Al concentrations (mM) in var. Gravesac in vitro.

Porém, existem outros sintomas também relacionados com o sistema radicular, atribuídos ao alumínio, que puderam ser observados no cultivo in vitro. Ocorreu a inibição do alongamento do eixo principal, também verificado por Furlani et al. (2002) e Fráguas (1999), presença de raízes com coloração marrom, principalmente nas extremidades (Figura 4), conforme relatado por Basso et al. (2000) que trabalhou especificamente com porta-enxertos de videira.

Observaram-se também raízes laterais curtas e grossas (Figura 2), além de frágeis e quebradiças, com o início de emissão de raízes próximas ao ponto de crescimento da raiz principal (Figuras 3 e 4), também descrito por Basso et al. (2000). Ocorreu também o aparecimento de um sintoma característico não descrito na literatura: raízes secundárias com tamanho superior a raiz principal, que apresentava crescimento paralisado devido a reações provocadas pelo alumínio (Figura 3).

Quanto ao peso seco radicular, não se verificou relação com as diferentes concentrações de alumínio em ambas as variedades. Resultados estes que estão de acordo com Souza et al. (2000).

A redução de biomassa (peso seco) em plantas submetidas ao estresse de alumínio foi relatada por diversos autores (Burkhardt et al, 2008; Dantas et al., 2001), que verificaram que a ação do alumínio pode inibir o desenvolvimento radicular. Como existe uma correlação estreita entre o desenvolvimento do sistema radicular e a parte aérea das plantas, soluções com teores altos de alumínio promovem a inibição do desenvolvimento da folha/caule (Furlani et al., 2002).

Fig. 2 -Sintomas de toxicidez de alumínio no sistema radicular de porta-enxerto de videira Paulsen 1103 in vitro. Grande número de raízes laterais curtas e grossas (atrofiadas) com coloração escura. Concentração de Al = 0,425mM. UFSC - Fpolis/SC, Brasil.

Aluminum toxicity symptoms in the radicular system of grapevine rootstock Paulsen 1103 in vitro. Great number of short and thick lateral roots (atrophied) with dark coloration. Al concentration = 0,425mM. UFSC - Fpolis/SC, Brasil.

Fig. 3 -Sintomas de morte do meristema apical com emissão de uma nova raiz próxima ao ápice radicular em porta-enxerto de videira Paulsen 1103 in vitro. Evidenciado em (A) a nova raiz que apresenta tamanho semelhante a original. Em (B) mudança típica de coloração da nova raiz. Concentração de Al=0,425mM. UFSC - Fpolis/SC, Brasil.

Symptoms of meristema apical death with emission of a new root next to radicular system in grapevine rootstock Paulsen 1103 in vitro.Evidenced in (A) the new root that presents similar size the original. In (B) typical change of coloration of the new root. Concentration ofAl=0,425mM. UFSC - Fpolis/SC, Brasil.

Fig. 4 -Sintomas causados pela toxicidez por alumínio em porta-enxertos de videira Paulsen 1103 in vitro. (A) paralisação do crescimento apical radicular; as concentrações de alumínio são respectivamente de 0,425 mM, 0,650 mM, e 1,375 mM. (B) raízes anormais e com coloração escura (Al = 1,2 mM). UFSC - Fpolis/SC, Brasil.

Como sintomas visuais da toxicidez por alumínio no caule, a variedade Paulsen 1103 apresentou morte das pontas de crescimento (verificado a partir da segunda semana de tratamento). Este sintoma é normalmente relacionado à deficiência de cálcio provocado pelo alumínio (Foy, 1988). Tais observações estão de acordo com Fráguas (1999), que relatou grandes reduções nos teores de cálcio da variedade Paulsen 1103, submetida ao estresse de alumínio.

Observa-se que a variedade Gravesac (Figura 5A) apresentou uma regressão quadrática, onde aumentos nas concentrações de alumínio até 0,650mM promovem um incremento da área foliar, e concentrações superiores a 0,650mM restringem progressivamente o crescimento das folhas. A variedade Paulsen 1103 (Figura 5B), apresentou redução da área foliar nas concentrações de alumínio a partir de 0,250mM. Em concentrações superiores a esta, o alumínio passa a exercer um efeito fitotóxico reduzindo o crescimento da área foliar até a concentração de 1,0mM, estabilizando em concentrações mais elevadas.

Fig. 5A - Relação da área foliar (cm2), em função das concentrações de Al (mM) para a var. Gravesac in vitro.

Relation of foliar area (cm2), in function of Al concentratios (mM) in var. Gravesac in vitro.

Fig. 5B - Relação da área foliar (cm2), em função das concentrações de Al (mM) para a var. Paulsen 1103 in vitro.

Relation of foliar area (cm2), in function of Al concentratios (mM) in var. Paulsen 1103 in vitro.

Diversos pesquisadores sugerem que as células das raízes e protoplastos respondem, na presença do alumínio, com mudanças fisiológicas necessárias para restabelecer a homeostase interna, mecanismos possíveis apenas em altas concentrações de Ca⁺² e K⁺ (Lindberg e Strid, 1997). E, que o alumínio bloqueia os transportadores de Ca⁺² presentes na membrana plasmática, podendo ser uma das principais atividades fitotóxicas exercidas pelo alumínio (Jones et al., 1998).

De maneira geral, as médias do peso seco das folhas para a variedade Gravesac (Figura 6A) não apresentaram correlações negativas com as concentrações de alumínio, demonstrando um certo efeito positivo na produção de biomassa seca nas concentrações de alumínio entre 0.650mM e 1.0mM, com decréscimo em concentrações superiores. Na variedade Paulsen 1103 (Figura 6B), observou-se que em 0,250mM de Al ocorreu um pequeno acréscimo de biomassa nas folhas, porém nas concentrações superiores a esta, verificou-se redução dos pesos secos das folhas até atingir valores mínimos de crescimento foliar nas concentrações superiores a 1,0mM de Al. O alumínio induz reduções na fotossíntese, mecanismo que está em parte associado com o fechamento dos estômatos, fenômeno que provavelmente é resultante de prejuízos causados pelo alumínio, que afetam o metabolismo de carbono e a regulação dos estômatos (Codognotto et al., 2002; Peixoto et al., 2002).

Fig. 6A -Relação do peso seco das folhas (mg) em função das concentrações de Al (mM) na var. Gravesac in vitro.

Relation of dry weight of leves (mg), in function of Al concentratios (mM) in var. Gravesac in vitro.

Fig. 6B - Relação do peso seco das folhas (mg) em função das concentrações de Al (mM) na var. Paulsen 1103 in vitro.

Relation of dry weight of leves (mg), in function of Al concentratios (mM) in var. Paulsen 1103 in vitro.

Fig. 7A - Relação do peso seco da parte aérea (caule + folhas), em função das concentrações de Al (mM) na var. Gravesac in vitro.

Relation of aerial part dry weight, in function of Al concentratios (mM) in var. Gravesac in vitro.

Fig. 7B - Relação do peso seco da parte aérea (caule + folhas), em função das concentrações de Al (mM) na var. Paulsen 1103 in vitro.

Relation of aerial part dry weight, in function of Al concentratios (mM) in var. Paulsen 1103 in vitro.

Para a variedade Paulsen 1103 (Figura 7B), observouse uma maior sensibilidade ao alumínio. Verificouse na concentração 0,250mM de alumínio um estímulo ao acúmulo de biomassa na parte aérea. Entretanto, a partir desta concentração verifica-se uma queda acentuada no peso seco da parte aérea.

Comin et al. (1999), trabalhando com as variedades de videiras Paulsen 1103 e Gravesac, em solução nutritiva, verificaram redução do peso seco da parte aérea, correlacionado com acréscimo nas concentrações de alumínio. Entretanto, Fráguas (1999), em trabalhos de campo, avaliando diferentes variedades de porta-enxertos de videira, verificou que existe variabilidade entre genótipos com relação a estresse de Al. Essas diferenças são devidas aos vários fatores que estão envolvidos, como questões de tolerância de genótipos, metodologias, concentrações e/ou atividades de Al.

Como análises finais, buscaram-se comparar a distribuição do carbono (partição de biomassa) entre o sistema radicular e a planta como um todo. Os resultados para a variedade Gravesac estão apresentados nas Figura 8A.

Fig. 8A - Relação peso seco raízes/peso seco total, em função das concentrações de Al (mM) para a var. Gravesac in vitro.

Relation of dry weight roots/total dry weight, in function of Al concentratios (mM) in var. Gravesac in vitro.

Verificou-se que existe uma grande estabilidade entre a relação do peso seco radicular e o peso seco total (PSR/PST), até a concentração de alumínio de 0,650. Para concentrações superiores esta relação se altera, apresentando valores maiores. A variedade Paulsen 1103 (Figura 8B), por sua vez, apesar de não ter apresentado regressão significativa para esta variável, apresentou um padrão de elevação da relação bem definido, com acréscimos praticamente constantes a medida que aumenta a concentração de alumínio. Elevação esta que se faz notar desde a primeira concentração de Al utilizada.

Fig. 8B - Relação peso seco raízes/peso seco total, em função das concentrações de Al (mM) para a var. Paulsen 1103 in vitro.

Relation of aerial part dry weight, in function of Al concentratios (mM) in var. Paulsen 1103 in vitro.

O alumínio é um dos principais responsáveis pela baixa performance de plantas economicamente importantes em solos ácidos. Das espécies de alumínio, a forma Al³⁺ é comprovadamente tóxica e o sintoma inicial, e mais nocivo de sua toxicidade, é a inibição do crescimento da raiz. Espécies de plantas variam extensivamente no grau de tolerância ao Al e as plantas tolerantes apresentam diferentes mecanismos para sobreviverem à presença desse metal. Os mecanismos de tolerância são extremamente complexos e vários estudos vêm sendo realizados na tentativa de elucidá-los (Echart e Cavalli-Molina, 2001).

Devido à complexidade da fitotoxicidade do Al e dos mecanismos de tolerância apresentados pelas plantas, bem como da interação com diferentes fatores do solo, esse problema, além de ser um desafio para a biotecnologia vegetal, tem que ser alvo de cooperação entre cientistas multi-disciplinares. A elucidação dos vários aspectos envolvidos na fitotoxicidade do Al e obtenção de cultivares tolerantes ao mesmo permitirão futuramente um melhor aproveitamento dos solos ácidos ricos em Al que representam em algumas regiões brasileiras um sério problema brasileiro.

CONCLUSÕES

As avaliações morfo-fisiológicas demonstraram comportamentos distintos entre as variedades, com relação às concentrações de Al.

Ocorreu correlação negativa entre atividades de Al+3 e produção de biomassa.

A partição de carbono entre as variedades foi alterada pelas diversas concentrações de Al.

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¹Mestre em Biotecnologia, UFSC, Florianópolis, SC.

²Pós-doutoranda em Fitotecnia, EPAMIG/FAPEMIG, Bairro Vargedo, Maria da Fé, MG, CEP: 37517-000, e-mail: fvilla2003@libero.it

³D.Sc., Professor Adjunto, Centro de Ciências Agrárias, UFSC, Florianópolis, SC.

⁴D.Sc., Professor Adjunto, Departamento de Agricultura, UFLA, Lavras, MG, CEP.: 37200-000; e-mail: mpasqual@ufla.br