Diversidade de microrganismos relacionados com a biocorrosão no sistema óleo e gás

Diversity of microrganisms related to biocorrosion in oil and gas systems

T. Rodrigues, A. de Oliveira, D. Coutinho, L. Guerreiro, M. Galvão, P. Souza, S. Charret, V. de Oliveira e M. Lutterbach(*)

LABIO – Laboratório de Biocorrosão e Biodegradação – Divisão de Corrosão e Degradação – Instituto Nacional de Tecnologia. Av. Venezuela, 82, Sala 616. CEP: 20081-312, Centro. Rio de Janeiro, Brasil. E-mails: thais.rodrigues@int.gov.br, ana.chaves@int.gov.br, diogo.azevedo@int.gov.br, luana.guerreiro@int.gov.br, mariana.galvao@gmail.com,pamella.souza@int.gov.br, sylviane.charret@int.gov.br, viviane.oliveira@int.gov.br

(*) A quem a correspondência deve ser dirigida, e-mail: marcia.lutterbach@int.gov.br

RESUMO

O estudo da corrosão microbiologicamente induzida é importante no setor de óleo e gás devido aos danos provocados pelos microrganismos aos sistemas de produção, armazenamento, transporte e qualidade do produto final. Os microrganismos podem ser encontrados amplamente distribuídos na natureza e o seu crescimento e produtos metabólicos podem comprometer o rendimento de indústrias petroquímicas. Um fator importante para o desenvolvimento de microrganismos é a presença de água e nutrientes no meio. Este trabalho teve como objetivo analisar a diversidade microbiana em diferentes amostras das indústrias do setor de óleo e gás e relacioná-la com os processos de biocorrosão.

ABSTRACT

The study of microbiologically induced corrosion is important to the oil and gas industry due to the damage caused by microorganisms to production, storage, and transportation systems and to the final product quality. Microorganisms can be found widely distributed in nature and their growth and metabolic products can compromise the performance of petrochemical industries. An important factor for the development of microorganisms is the presence of water and nutrients in the medium. This study aimed to analyze the microbial diversity in different samples of the oil and gas industries and to relate it to the biocorrosion process.

Keywords: Microbial Diversity, Biocorrosion, Oil and Gas Systems

1. INTRODUÇÃO

O estudo da corrosão de metais influenciada pela presença de microrganismos em ambientes industriais e naturais merece destaque, pois estes podem provocar diversos tipos de danos aos sistemas, como entupimento de filtros e válvulas, devido à formação de biofilmes; aumento nos custos de bombeamento; risco de contaminação de produtos e redução na vida útil dos equipamentos. Este tipo de corrosão é encontrado com frequência na indústria petrolífera, tanto na fase de extração, como nas fases de distribuição e armazenamento [1].

Os microrganismos estão amplamente distribuídos no ambiente e são frequentemente encontrados em solos e águas naturais. Em sistemas de óleo e gás, podem estar presentes em gotículas de água em suspensão, na interfase água/combustível e também aderidos às paredes dos tanques de armazenamento.

A causa principal da contaminação microbiana em combustíveis é a presença de água no meio. Esta água pode ser inserida através de: condensação da umidade do ar contido no interior dos tanques; decantação da água dissolvida no combustível ou penetração de água de chuva pelo local de abastecimento.

Hormoconis resinae e Pseudomonas aeruginosa são os contaminantes microbianos mais frequentemente encontrados em sistemas de água/ combustível. Estes estão relacionados com a formação de biofouling e biocorrosão em ligas de ferro e alumínio.

A atividade metabólica dos microrganismos em sistemas de óleo e gás pode causar uma biocorrosão rápida e grave [4]. Produtos metabólicos corrosivos derivados da degradação microbiológica de um combustível, como sulfuretos, ácidos orgânicos e inorgânicos (incluindo ácido sulfúrico e sulfuroso) levam à degradação de revestimentos protetores de tanques, destroem ou inativam inibidores de corrosão e levam à corrosão localizada de tanques e equipamentos de injeção. O crescimento microbiano e a formação de tubérculos também estimulam a corrosão eletroquímica através de arejamento diferencial.

Sendo assim, o objetivo deste estudo é avaliar a diversidade de microrganismos presentes no sistema de óleo e gás a fim de ampliar o conhecimento sobre os grupos microbianos causadores de biocorrosão, facilitando ações que permitam manter a integridade do sistema frente ao ataque microbiológico.

2. METODOLOGIAS EXPERIMENTAIS

2.1 Amostragem

Amostras de querosene de aviação, biodiesel, petróleo e água do mar foram analisadas no laboratório de acordo com a necessidade de pesquisa. Estas foram coletadas sob responsabilidade do solicitante e analisadas num prazo de 48 horas. A partir destas amostras, os microrganismos cultiváveis foram isolados para identificação.

2.2 Identificação microbiana

2.2.1 Bactérias

As estirpes isoladas foram observadas ao microscópio ótico para avaliação da morfologia celular e determinação das características morfotintoriais. Para isto, as células foram coradas pelo método de coloração de GRAM. As características macroscópicas também foram observadas a partir das colônias microbianas que cresceram em agar.

As estirpes bacterianas isoladas foram preservadas em triplicados por congelamento em 5 % de DMSO a -80 ºC, após crescimento em meio de cultivo.

A identificação bacteriana foi realizada por meio de biologia molecular. As estirpes foram identificadas através da análise do gene rRNA 16S, seguindo as etapas [5]:

1. Extração de DNA – o DNA bacteriano foi extraído através de kits comerciais.

2. Amplificação de DNA – a replicação de sequencia de nucleotídeos do gene rRNA 16S foi realizada a partir da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando o “primer” universal Sadir (5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAGA-3’, forward) e S17 (5’ GTTACCTTGTTACGACTT-3 ‘, reverse).

3. Sequenciamento do gene de RNA 16S e identificação filogenética das estirpes – as sequências obtidas foram comparadas com as já disponíveis na base de dados GenBank utilizando o programa BLAST [6] para identificação da espécie.

As etapas seguidas desde o isolamento até a identificação das bactérias estão ilustradas no esquema da figura 1.

 

]]> 2.2.2 Fungos

Para detectar a presença de fungos, as amostras estudadas foram inoculadas em agar Sabouraud adicionado de cloranfenicol e posteriormente isoladas em agar extrato de malte, Czapek ou agar batata. Todas as placas foram incubadas a 25 ºC por 14 dias.

Após o isolamento das estirpes foi realizada uma identificação taxonômica mediante a observação das morfologias macroscópicas e microscópicas [7]. As estirpes fúngicas foram preservadas em óleo mineral. Para isto, as estirpes isoladas foram crescidas em agar batata e incubadas a 25 ºC. Após esporulação, a cultura foi coberta por uma camada de 3 mL de óleo mineral estéril e armazenada à temperatura ambiente.

A identificação filogenética foi realizada por biologia molecular através das seguintes etapas:

1. Lise celular por choque térmico – a lise celular foi realizada através de 3 ciclos de congelamento em nitrogênio e descongelamento em banho-maria a 60 ºC.

2. Extração de DNA – o DNA foi extraído através da utilização de kits comerciais.

3. Amplificação de DNA – o gene que codifica a região ITS foi amplificado utilizando o conjunto de "primers" ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’, forward) e ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’, reverse) [8].

4. Sequenciamento do DNA e identificação das espécies – os produtos de PCR foram purificados e sequenciados. As sequencias obtidas foram comparadas com as já disponíveis na base de dados GenBank utilizando o programa BLAST [6] para identificação da espécie.

 

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

]]> 3.1 Microrganismos isolados de querosene de aviação - QAV

Diversos microrganismos podem ser encontrados em tanques de aviões, e elevadas concentrações destes microrganismos indicam baixa qualidade do combustível. Neste caso, a qualidade do combustível é extremamente importante uma vez que problemas de contaminação microbiana podem acelerar a corrosão no tanque através de entupimento dos filtros e falhas nas bombas de combustível, comprometendo a segurança do voo [9, 10].

Na amostra de QAV analisada, foram encontradas 3 espécies do gênero Pseudomonas, suas características macroscópicas e microscópicas estão ilustradas na Tabela 1.

 

Este microrganismo também já foi encontrado em solo contaminado com derivados de petróleo e é comum ser citado na literatura pela capacidade de degradar hidrocarbonetos [11]. O gênero Pseudomonas é conhecido pela produção de exopolissacarídeo, uma matriz polimérica que favorece a formação do biofilme, importante para o processo corrosivo. Além disso, essas bactérias são capazes de precipitar o ferro formando tubérculos de óxido de ferro que se depositam sobre as superfícies metálicas.

A pesquisa por fungos mostrou a presença de Hormoconis resinae na amostra de QAV estudada. O crescimento do fungo em agar está representado na figura 2 e sua característica microscópica na figura 3.

 

 

]]> A presença do fungo filamentoso Hormoconis resinae em QAV é considerada grave e potencialmente causadora de sérios problemas, pois este fungo produz uma grande quantidade de biomassa e adere fortemente à parede do tanque, dificultando a sua remoção mesmo com a drenagem da água presente no fundo de tanque.

3.2 Microrganismos isolados de biodiesel

Algumas estirpes bacterianas foram isoladas a partir de diferentes amostras de biodiesel: Bacillus cereus, Staphylococcus pasteuri e Cupriavidus pauculus (Tabela 2). Estes microrganismos são diferentes dos normalmente isolados de diesel. Há evidências de que o biodiesel seja maisp ropenso à contaminação microbiológica do que o diesel de origem fóssil [12].

 

O fungo Aureobasidium pullulans também foi isolado de amostras de biodiesel. Este fungo é conhecido pela sua produção de polissacarídeo (pululana), o que leva ao comprometimento da qualidade do combustível, pois além de aumentar a viscosidade do produto, pode causar entupimento do sistema.

3.3 Microrganismos isolados de petróleo

O crescimento de microrganismos na cadeia de produção de petróleo pode causar problemas de degradação do combustível, além de problemas relacionados com a corrosão microbiologicamente induzida de tanques e dutos.

Diversas espécies de microrganismos foram relatadas como responsáveis pela deterioração de hidrocarbonetos e derivados sob condições aeróbicas e anaeróbicas. Eles utilizam estes compostos como fonte de carbono e energia. Os principais gêneros de bactérias capazes de degradar compostos do petróleo são Acidovorans, Acinetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Aeromonas, Arthrobacter, Burkholderia, Bacillus, Comomonas, Corynebacterium, Cycloclasticus, Flavobacterium, Gordonia, Microbacterium, Moraxella, Mycobacterium, Micrococcus, Neptunomonas, Nocardia, Paracoccus, Pasteurella, Polaromonas, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodococcus, Sphingomonas, Stenotrophomonas, Streptomyce e Vibrio [13]. Porém nenhum destes gêneros foi encontrado na amostra analisada. Após o isolamento dos microrganismos de uma amostra de petróleo, foi possível identificar três estirpes de bactérias. Enterobacter asburiae; Rhodobacter capsulatus e Ochrobactrum tritici. Como exemplo, apresentamos as características fenotípicas da espécie Rhodobacter capsulatus na figura 4.

]]>  

Além de espécies de bactérias, foi isolada da fase óleo de um tanque de armazenamento de petróleo uma espécie do fungo Penicillium, o Penicillium citrinum. A figura 5 ilustra as características morfológicas deste fungo.

 

3.4 Microrganismos isolados de água do mar

A água é um elemento fundamental para manutenção da vida em diversos ambientes. Sendo assim, a diversidade de microrganismos encontrada em processos que envolvam a água é bem grande.

A água do mar utilizada para injeção em poços de petróleo para recuperação do óleo fornece condições favoráveis para o crescimento microbiano, pois possuem altas concentrações de cloretos e hidrocarbonetos que podem ser utilizados como fonte de nutrientes [14].

Em plataformas de petróleo offshore os maiores problemas de biocorrosão estão relacionados com as incrustações, perfurações, problemas no armazenamento e transporte do produto e sistema de injeção de água [4].

Amostras de água de produção foram analisadas e diferentes espécies microbianos foram isolados. Observou-se a presença de Pseudomonas stutizeri, Salinicola salarius, Bacillus cereus, Marinobacterium sediminicola, 3 espécies do gênero Vibrio, Vibrio sinaloensis, Vibrio corallilyticus e Vibrio neptunensis, além dos fungos Aspergillus versicolor e Penicillium citrinum.

Penicillium citrinum é conhecido pela sua capacidade de degradar substâncias consideradas tóxicas como pesticidas, inibidores de corrosão e plastificantes [15].

]]> As características morfológicas das bactérias Salinicola salarius e Marinobacterium sediminicola e do fungo Aspergillus versicolor, estão ilustradas na

 

 

4. CONCLUSÕES

O gênero Pseudomonas já foi relatado em diversas amostras de processos corrosivos e foi isolado a partir de amostras de QAV, petróleo e água de produção. Essas bactérias são extremamente versáteis, o que as torna capazes de sobreviver numa grande variedade de ambientes. Este gênero já foi citado na literatura como capaz de degradar hidrocarbonetos e estão frequentemente associados a problemas de biocorrosão em sistemas de água e combustível [1, 11].

A espécie Bacillus cereus é um microrganismo amplamente distribuído na natureza. Este microrganismo é importante nas indústrias do sistema de óleo e gás devido à sua capacidade de formar biofilmes em estruturas metálicas. Além disto, são microrganismos formadores de esporos, o que confere resistência adicional a processos de limpeza e agentes antimicrobianos [16]. A presença deste microrganismo pode comprometer sistemas de produção, transporte, armazenamento e qualidade final de produtos. Neste trabalho foi possível observar a presença de B. cereus em biodiesel e água de produção.

Dentre os fungos isolados, foi identificado o Penicillium citrinum, presente em petróleo e água de produção. Os fungos possuem capacidade de sobreviver a condições adversas do meio ambiente devido a formação de esporos, que são estruturas de resistência. A presença de fungos pode contribuir para o aumento da espessura dos biofilmes.

Todos os microrganismos isolados, caracterizados e identificados neste trabalho encontram-se mantidos em banco de culturas do laborátorio. Esses microrganismos também são utilizados para estudos de resistência de materiais, eficiência de biocidas, degradação de combustíveis, entre outros.

No entanto, a diversidade microbiana de ambientes naturais é enorme e o cultivo de microrganismos em laboratório não reflete as reais condições do ambiente, pois apenas uma minoria das bactérias é capaz de crescer em meios de cultivo. Sendo assim, estes resultados refletem uma pequena parcela da diversidade real destes ambientes, podendo ser utilizado como estudo preliminar no conhecimento da diversidade microbiana destes locais. Para uma análise mais completa, técnicas de biologia molecular como clonagem gênica e pirosequenciamento podem ser aplicadas para o entendimento da comunidade microbiana, incluindo os microrganismos não cultiváveis.

]]> No geral, os processos de biocorrosão são associados não somente aos microrganismos, mas também aos seus produtos metabólicos e à presença de água, mesmo que em pequena quantidade. Por isso é importante conhecer a diversidade de microrganismos presentes nestes ambientes e tomar medidas preventivas contra o ataque microbiano.

 

REFERÊNCIAS

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AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à PETROBRAS pelo suporte financeiro a pesquisas no LABIO - laboratório de Biocorrosão e Biodegradação.

Artigo submetido em 22 de Maio de 2013 e aceite em Outubro de 2013