M. R. Martins^1,2, F. Santos¹, P. Candeias¹ & J. Cruz-Morais^1,2

¹ Departamento de Química, Universidade de Évora, Rua Romão Ramalho, 7000-671 Évora, e-mail: cmorais@uevora.pt;

²ICAM, Universidade de Évora, Apartado 94, 7002-554 Évora

RESUMO

As actividades das enzimas no solo são um importante indicador da sua qualida­de. Neste estudo procedeu-se à caracteri­zação da actividade enzimática de desi­drogenases (EC 1.1.1) e da urease (EC 3.5.1.5) de um solo sob Olea europeae L. da região de Évora. As constantes cinéti­cas K_m e V_máx, foram determinadas usando como substratos o cloreto de p­-iodonitrotetrazolio (INT) e a ureia, res­pectivamente. Foi avaliado o efeito nas referidas actividades provocado pelo pH, temperatura e vestígios de Hg²⁺ e de Pb²⁺.

As actividades máximas obtiveram-se a pH = 8,5 e 40 ºC, com K_m= 0,5 mM e V_máx = 5,4 µmol min^-1 g^-1, para a activida­de de desidrogenases e a pH = 10 e 37 ºC, com K_m = 25,7 mM e V_máx = 2,0x10^-2 µmol min^-1 g^-1, para a urease. Estas acti­vidades foram inibidas por diferentes concentrações de Hg²⁺, mas apenas a acti­vidade da urease foi inibida pelo Pb²⁺. Estes resultados são comparáveis com os referidos na literatura para estes enzimas.

Palavras-chave: Desidrogenases, Enzi­mas do solo, Qualidade do solo, Urease.

Effect of temperature, pH and Hg²⁺ and Pb²⁺ traces in dehydrogenaseand urease activities of a soil from Évora region

ABSTRACT

Enzyme activities are often used as in­dicator of soil quality. This study reports on dehydrogenase (EC 1.1.1) and urease (EC 3.5.1.5) activities of a soil under Olea europaea L. from Évora region. Kinetic constants Km and Vmax were determined using p-iodonitrotetrazolium chloride (INT) and urea, respectively. Effects of pH, temperature and Hg²⁺ and Pb²⁺ traces on both activities were determined.

Maximal activity was obtained at pH = 8.5 and 40ºC, K_m = 0.5 mM and V_max=5,4µmol min^-1 g^-1 , for dehydro­genase and at pH = 10 and 37 ºC, Km = 25.7 mM and V_max = 2.0x10^-2 µmol min^-1 g^-1, for urease. These activities were in­hibited by different concentrations of Hg²⁺, but only the urease activity was in­hibited by Pb²⁺. Results of this study are comparable to those reported in the litera­ture for these enzymes.

Key-words: Dehydrogenases, Soil enzyme, Soil quality, Urease.

INTRODUÇÃO

A qualidade do solo depende de proprie­dades físico-químicas e biológicas relacio­nadas com a sua textura, composição, humidade, pH, microrganismos e enzimas activos nele presentes, os quais podem ser influenciados pelo tipo de culturas, mobili­zação do solo e aplicação de xenobióticos, como produtos fitofarmacêuticos, poluentes de origem industrial, municipal ou outros. Os enzimas do solo têm um papel relevante na libertação dos nutrientes necessários ao crescimento microbiano e das plantas e na biotransformação de xenobióticos (Dick, 1998). As actividades enzimáticas do solo podem resultar de células activas (animais, plantas e microrganismos), células inteiras já mortas, detritos celulares ou, ainda, de complexos enzima-argila ou colóides húmi­cos (Taylor et al., 2002).

As actividades enzimáticas de desidroge­nases (E.C. 1.1.1), fosfatases (EC 3.1.3.), arilsulfatase (EC. 3.1.6.1.), celulase (E.C. 3.2.1.4), β-glucosidase (E.C. 3.2.1.21) e urease (E.C. 3.5.1.5) têm sido utilizadas, nalguns estudos, como indicadores da qua­lidade do solo. Desidrogenases, por exem­plo, são enzimas endocelulares, presentes apenas nas células viáveis e a sua actividade no solo está descrita como reflexo da activi­dade de microrganismos, incluindo bactérias e fungos, pelo que é frequentemente utiliza­da como indicador do metabolismo oxidati­vo microbiano em função do tipo, profundi­dade, conteúdo de matéria orgânica e poluentes do solo (Camiña et al. 1998; Tra­sar-Cepeda et al., 2000; Monkiedje et al., 2002; Taylor et al., 2002; Sukul, 2006).

A acumulação de metais pesados no solo em quantidades elevadas é um dos factores de maior impacte nos seus processos bio­químicos. Alguns estudos mostram que a presença de metais pesados inibe a activida­de de diversos enzimas do solo (Mora et al., 2005; Chaperon et al., 2007, 2008). O grau de inibição das actividades enzimáticas do solo pelos metais pesados está estreitamente correlacionado com o tipo de solo (Brady & Ray, 1999). Mora et al. (2005) refere que solos contaminados com os metais As, Cd, Cu, Mn, Pb e Zn apresentaram actividades enzimáticas de desidrogenases, arilsulfatase e β-glucosidase muito baixas, as quais aumentaram após remediação “ in situ” (Sevilha, Espanha). Segundo Chaperon et al. (2007, 2008), a presença de Ag, Cu, Pb, Zn e Hg influenciou as actividades de desi­drogenases e da urease em solos de floresta (Canadá), dependendo da concentração, da presença simultânea de alguns destes metais e do tipo de solo.

Estudos de caracterização de actividades de desidrogenases e urease nos solos de Por­tugal são muito escassos, pelo que foi objec­tivo do presente estudo caracterizar a activi­dade enzimática de desidrogenases e da urease num solo da região de Évora (Alente­jo) e avaliar o efeito de Hg²⁺ e Pb²⁺, nessas actividades. A actividade de desidrogenases foi determinada pelo método de von Mersi & Schinner (1991) modificado (Camiña et al., 1998) e a da urease pelo método de Kandeler & Gerber (1988) modificado. As constantes cinéticas, Km e Vmáx foram deter­minadas utilizando como substratos o p-iodonitrotetrazolio (INT) e a ureia, para desidrogenases e urease, respectivamente. Foi ainda avaliado o efeito da temperatura, pH e de vestígios de Hg²⁺ e Pb²⁺ nas referi­das actividades.

MATERIAL E MÉTODOS

Estudou-se um solo do sudoeste de Portu­gal situado em Évora, Alentejo (38º36’N, 1º16’W) com cultura de olival (Olea euro­peae L.) em pousio, sem quaisquer trata­mentos com pesticidas, adubos ou fertilizan­tes, durante os últimos 10 anos. De acordo com a carta de solos 36 C dos Solos de Por­tugal, trata-se de um solo litólico, não húmi­co de rochas eruptivas (Pmg) (Cardoso, 1974). As amostras foram recolhidas entre os 5 – 15 cm de profundidade, secas ao ar, crivadas por tamiz de malha < 2 mm e guardadas a 4ºC, para análise.

As principais características físico­químicas do solo foram determinadas de acordo com os métodos de referência para análises do solo (Carter, 1993; Rowell, 1994). Os dados da textura foram obtidos por sedimentometria com raios X (Sedi­graph, 5100), corrigidos para o método da análise mecânica, sem destruição de carbo­natos. O azoto total foi determinado pelo método de Kjeldahl, o azoto nítrico por potenciometria, utilizando um eléctrodo selectivo de iões, e o fósforo pelo método espectrométrico de Egner-Riehm (Green­berg et al., 1992). A capacidade de troca foi determinada pelo método do acetato de amónio a pH = 7 (Rowell, 1994). O Ca²⁺ foi quantificado por espectrometria de absorção atómica em câmara de grafite e o Na⁺ e K⁺ por fotometria de emissão de chama (Rowell, 1994).

A actividade de desidrogenases foi deter­minada em 1 g de solo (p.s.) pelo método de von Mersi & Schinner (1991) modificado por Camiña et al. (1998), utilizando como substrato o cloreto de 2-p-iodofenil-3-p­nitrofenil-5-feniltetrazolio (INT), que é con­vertido por desidrogenases em iodonitrote­trazólio-formazão (INTF). Este foi extraído com uma mistura de dimetilformamida e etanol, de modo a minimizar a adsorção do INTF aos minerais do solo (Camiña et al., 1998) e quantificado a 490 nm (Taylor et al., 2002). Foi efectuado um ensaio em branco nas mesmas condições, tendo-se adi­cionado o substrato só após a adição da solução extractante.

A actividade da urease foi quantificada pelo método de Kandeler & Gerber (1988) modificado, sendo o amónio libertado determinado pela reacção de Berthelot, na qual o salicilato de sódio reage com o ácido dicloroisocianúrico, na presença de nitro­prussiato de sódio, formando um complexo esverdeado em meio alcalino (Kandeler & Gerber, 1988; Taylor et al., 2002). Neste ensaio, adicionou-se 1 g de solo (p.s.) a 0,5 mL de solução de ureia 720 mM e 4 mL de solução tampão borato 75 mM, pH 10 e incubação a 37 ºC (b.a.) durante 2 horas, sob agitação. A reacção foi terminada com a adição de 6mL de KCl/HCl pH ~ 2 e, após 30 minutos, procedeu-se à leitura da absor­vência a 690nm. Foi efectuado um ensaio em branco nas mesmas condições, tendo-se adicionado o substrato só após a adição da solução de KCl/HCl. Em todas as determi­nações enzimáticas, foram efectuados 4 replicados.

O efeito da temperatura nas actividades enzimáticas de desidrogenases e urease foi avaliado fazendo variar a temperatura de incubação do solo entre 20 -50 ºC e o pH entre 6,5 e 12, respectivamente, com base em estudos prévios e nos valores indicados na literatura para estes enzimas (Trevors, 1984; Kandeler & Gerber, 1988; Subhani et al., 2001; Taylor et al., 2002).

Os efeitos do Hg²⁺ e Pb²⁺ nas actividades enzimáticas de desidrogenases e urease do solo foram determinados adicionando à solução do solo, soluções de HgCl₂ (0,23­10,91 mM) e soluções de PbCl₂ (0,14 ­10,91 mM). Nos ensaios em que se obser­vou um efeito inibitório, procedeu-se à determinação dos valores de IC₅₀ (concen­tração que levou a uma diminuição de 50% na actividade enzimática, como resposta dos microrganismos sensíveis ao respectivo metal).

Para avaliação do efeito do Hg²⁺ e Pb²⁺ nas actividades enzimáticas de desidrogena­ses e urease, procedeu-se à análise de variância (ANOVA -One way) para um intervalo de confiança de 95 % (P < 0,05), usando o programa SPSS^® 16.0 para Win­dows.

O efeito inibitório sobre as actividades de desidrogenases e urease provocado por cada um dos metais em estudo foi determinado usando a correlação dose-resposta para cada um dos metais adicionado ao solo. A Equação 1 foi utilizada para cálculo da resposta da actividade enzimática (Greco et al., 1995)

em que A₂ e A₁ são, respectivamente, as respostas máxima e mínima dos enzimas do solo obtidas com uma amostra controlo, p é o parâmetro de declive da curva dose­-resposta, X é a dose aplicada e log X₀ é a concentração que corresponde a 50 % da actividade enzimática. Este modelo não linear foi ajustado utilizando o Origin 7.1 (OriginLab^® Corporation, 2003).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O Quadro 1, mostra que o solo apresentou uma textura franco-argilosa, com pH 6,0, baixos valores de condutividade eléctrica e de matéria orgânica, valores estes que se encontram dentro dos limites referidos para um solo do tipo litólico, não húmico de rochas eruptivas (Pmg), como foi o caso do solo em estudo (Cardoso, 1974).

Neste estudo, as actividades de desidro­genases e urease do solo, foram determina­das a diferentes valores de temperatura, uti­lizando um valor de pH de ensaio de 8,5 para desidrogenases e de 10,0 para a urease, valores estes seleccionados tendo em conta estudos prévios e também o que se encontra referido na literatura sobre o efeito do pH na actividade destes enzimas (Trevors, 1984; Kandeler & Gerber, 1988).

Na Figura 1, estão representados os valo­res médio ± desvio-padrão da variação das actividades de desidrogenases e urease no solo em função da temperatura (Figura 1-A) e do pH (Figura 1-B).

Figura 1 -Representação gráfica do efeito da temperatura (A) e do pH (B) nas actividades de desi­drogenases e urease no solo em estudo.

Os valores de temperatura para os quais se obteve a maior actividade de desidro­genases e urease foram, respectivamente, de 40ºC e de 37ºC (Figura 1-A). Estes valores estão muito próximos, no entanto, como se observa na referida figura, o efeito da tem­peratura foi muito mais acentuado para a actividade da urease do que para a activida­de de desidrogenases, o que poderá signifi­car que, sendo a urease um enzima predo­minantemente extracelular, estará menos protegido do que as desidrogenases face a alterações da temperatura ambiental (Dick, 1998; Nannipieri et al., 2003).

Uma vez determinadas as temperaturas para as quais as actividades de desidrogena­ses e urease foram máximas, procedeu-se a um estudo do efeito da variação do pH sobre as actividades destes enzimas a essas tempe­raturas (40 ºC e 37 ºC, respectivamente).

Para a actividade de desidrogenases, o valor máximo foi obtido a pH 8,5, enquanto que para a urease a actividade máxima foi obtida a pH 10,0, mostrando que, no solo em estudo, a actividade destes enzimas face ao pH seguiu um padrão de comportamento dentro do que está referido para estes enzi­mas (Dick, 1998; Taylor et al., 2002).

Os parâmetros cinéticos das actividades de desidrogenases e urease foram determi­nados a 40ºC, pH = 8,5 e 37 ºC, pH = 10, respectivamente. Para este estudo foram usadas diferentes concentrações dos substra­tos ([S]) característicos destes enzimas e os correspondentes valores das velocidades inicias de reacção (V). Os valores das cons­tantes cinéticas, K_m e V_máx foram, então, determinados recorrendo à equação de Lineweaver-Burk: 1/V = {(K_m/V_máx). (1/[S]) + (1/V_máx)} (Equação 2.), a qual usa o inverso da equação de Michaelis-Menten (Tabatabay & Bremner, 1971). Na Figura 2, V_máx corresponde ao valor de 1/[S] =0 e K_m ao valor de 1/V=0 da equação anterior.

Figura 2 -Representação gráfica de Lineweaver-Burk para determinação das constantes cinéticas Km e Vmáx da reacção de desidrogenases (A) e urease (B) do solo em estudo.

Os valores obtidos foram, para as desi­drogenases, K_m = 0,50 mM e V_máx = 5,33 µmol min^-1 g^-1 e, para a urease, K_m = 25,73 mM e V_máx = 2,00x10^-2 µmol min^-1 g^-1. Uti­lizando a equação de Michaelis-Menten os valores obtidos para as constantes cinéticas foram semelhantes (K_m = 0,49 ± 0,17 mM; V_máx = 5,31 ± 0,18 µmol min^-1 g^-1 para a actividade de desidrogenases, e K_m = 25,78 ± 0,27 mM; V_máx = 2,00x10^-2 ± 0,03x10^­2µmol min^-1 g^-1 para a actividade da urease), o que mostra que a equação de Lineweaver-Burk é aplicável neste caso.

Para as actividades de desidrogenases e urease, não se encontram descritos na litera­tura estudos para este tipo de solos. Os resultados do presente estudo mostram um valor de actividade de desidrogenases 10² vezes mais elevado do que os valores obti­dos em outros tipos de solo. Tal diferença poderá ter-se devido ao facto de no nosso estudo existir uma flora microbiana mais abundante do que no caso descrito na litera­tura (Taylor et al. 2002; Roldán et al, 2005), o que não foi estudado em ambos os casos; termos utilizado um solo em pousio há 10 anos, pois a actividade de desidrogenases pode diminuir significativamente com a fre­quência e profundidade da lavoura do solo (Roldán et al., 2005); termos utilizado o INT, pois a maioria dos estudos publicados foram obtidos com TTC (cloreto de 3,5­trifeniltetrazónio) e com este substrato os resultados são normalmente inferiores aos que se obtêm com INT (Trevors, 1984; Friedel et al., 1994); ou, finalmente, termos usado uma mistura extractante constituída por dimetilformamida/etanol, a qual permi­te quantificar valores mais elevados, nomeadamente em solos com teores médios ou elevados de argila (Camiña et al., 1998), como no solo que estudámos.

Relativamente à urease, os valores de actividade que obtivemos são da mesma ordem de grandeza de alguns descritos por outros investigadores, embora estes valores também sejam dependentes do tipo de solo, profundidade e vegetação (Sinsabaugh et al., 2000; Taylor et al., 2002; Roldán et al., 2005).

No presente trabalho, depois de termos caracterizado as actividades de desidroge­nases e urease do solo em estudo, através da determinação do seu V_máx e K_m, proce­demos à avaliação do efeito de quantidades crescentes de Hg²⁺ e Pb²⁺ sobre as activi­dades dos referidos enzimas, tendo em vis­ta a determinação da concentrações efecti­vas para as quais se obteria 50% de inibi­ção dessa actividade (IC50), parâmetro este que permite comparar o efeito deletério dos xenobióticos sobre os microrganismos que lhes são sensíveis.

O efeito de Hg²⁺ e Pb²⁺ nas actividades de desidrogenases e da urease estão ilus­trados no Quadro 2., mostrando que o Hg²⁺ diminuiu significativamente as actividades de desidrogenases e urease (P < 0,05), enquanto que o Pb²⁺ apenas diminuiu sig­nificativamente a actividade da urease (P < 0,05).

Nos estudos em que se observou uma correlação dose-resposta significativa (P<0,05), os valores de actividade foram analisados de acordo com a Equação 1, referida anteriormente, tendo em vista o cálculo dos valores de IC₅₀, e construíram­se as curvas dose-resposta das actividades de desidrogenases e urease versus concen­trações de Hg²⁺ ou Pb²⁺ , como ilustrado na Figura 3.

Figura 3 -Representação gráfica das curvas dose-resposta das actividades de desidrogenases e urease sensíveis à presença de Hg²⁺ e Pb²⁺.

A actividade de desidrogenases mostrou­se sensível à presença de Hg²⁺, com um valor de IC₅₀ de 0,249 ± 0,018 mM, mas não se mostrou significativamente sensível à presença de quantidades vestigiais de Pb²⁺ (P > 0,05). Relativamente à actividade da urease, para concentrações até 1,4 mM de Hg²⁺ e 0,7 mM de Pb²⁺, observou-se um efeito potenciador desta actividade. No entanto, para concentrações mais elevadas destes metais observou-se uma diminuição da actividade da urease, com valores de IC₅₀ de 3,47 ± 0,17 mM e de 3,31 ± 0,45 mM, para o Hg²⁺ e para o Pb²⁺, respectivamente.

Os estudos referidos na literatura que mais se aproximam do aqui descrito foram efectuados por Chaperon & Sauvé (2007, 2008). Estes investigadores utilizaram quantidades muito menores destes metais e outro tipo de solo com uma ocupação dife­rente, tendo obtido valores de IC50 cerca de cem vezes inferiores aos que obtivemos neste trabalho, o que pode querer significar que os enzimas do solo que analisámos são muito mais estáveis à presença de Hg²⁺ e Pb²⁺ do que no caso referido.

No trabalho que aqui apresentamos, dife­rentes concentrações de Hg²⁺ e Pb²⁺ produ­ziram, face a desidrogenases e urease, uma diminuição da actividade enzimática, mas em nenhum caso se obteve uma inibição total das referidas actividades. Isso mostra que num solo em pousio pode existir uma flora resistente à acção do Hg²⁺ e Pb²⁺ . Além disso, observou-se que o Pb²⁺ não ini­biu a actividade de desidrogenases, o que levanta a questão da flora microbiana do solo estudado ou de pelo menos uma parte importante da mesma, poder vir a ter inte­resse para beneficiar solos poluídos pelo Pb²⁺ em que esta actividade seja muito bai­xa. É neste sentido que os nossos estudos futuros se irão dirigir.

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