Potencial of extracts and essencial oils of coriander, oregano and pennyroyal for the protection against phytopathogenic bacteria tomato

Luísa Moura^[1],[2] ,Custódia Barros^[3], Isabel Mourão^[1],[2] e Olívia Matos^[4]

^[1] Centro de Investigação de Montanha (CIMO), ESA - Instituto Politécnico de Bragança Campus de Stª Apolónia, Apartado 1172, 5301-855 Bragança. E-mail: luisamoura@esa.ipvc.pt

[2] Escola Superior Agrária, Instituto Politécnico de Viana do Castelo, Refóios, 4990-706 Ponte de Lima

^[3] APACI,R. Pedro Álvares Cabral, Nº118 1ºC 4750-197Arcozelo Barcelos

^[4] INRB, I.P., L-INIA. Quinta do Marquês, Av. Da Republica. Nova Oeiras 2784-505 Oeiras

RESUMO

Palavras-chave: actividade antibacteriana, Coriandrum sativum, Mentha pulegium, Origanum vulgar, planta aromática e medicinal.

ABSTRACT

This study aimed to evaluate the antimicrobial activity in vitro and the potential use of ethanol extracts and essential oils of coriander, oregano and pennyroyal to protect tomato against pith necrosis (TPN) caused by Pseudomonas corrugata or P. mediterranea, and agaist P. syringae pv. tomato. Under in vitro experimental conditions it is concluded that extracts and essential oils studied have biological potential, inhibiting, in appropriate concentrations, the growth of phytopathogenic microorganisms. Trials conducted in the greenhouse revealed that the application of ethanolic extracts and essential oils of coriander, oregano and pennyroyal, compared to the application of copper oxychloride, resulted in similar effects on disease incidence and severity, indicating that under greenhouse condition, these plant extracts may be an alternative to the use of copper compounds in the control of these diseases of tomato.

Keywords : antibacterial activity, Coriandrum sativum, medicinal and aromatic plants Mentha pulegium, Origanum vulgar.

INTRODUÇÃO

O tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) é atualmente uma das hortícolas mais consumidas a nível mundial, quer em fresco quer após transformação e processamento industrial, devido à menor perecibilidade comparativamente com outras hortícolas, à versatilidade da sua utilização e ao seu valor alimentar. Porém, as infecções causadas por bactérias, fungos, vírus ou nemátodes, causam prejuízos económicos elevados, representando um problema grave da produção de tomate.

Os meios de protecção disponíveis contra bactérias que causam doenças no tomateiro são reduzidos, principalmente no modo de produção biológico. Este problema deve-se à escassez de compostos antibacterianos comerciais adequados e eficazes. A utilização de antibióticos, além de proibida em muitos países, pode não ser eficaz. As aplicações de compostos de cobre podem ser eficazes para reduzir o estabelecimento do inóculo, no entanto, é conhecida a resistência de certas bactérias ao cobre. Adicionalmente, estes compostos apresentam vários problemas de fitotoxicidade, acumulação no solo e necessidade de se efectuarem aplicações frequentes. Além destes aspectos, acrescem as restrições europeias recentes, que limitam o uso de sais de cobre (Balestra et al., 2009).

As plantas aromáticas (PAM) caracterizam-se por segregarem e acumularem óleos essenciais em estruturas especializadas. Estes óleos são constituídos por compostos voláteis pertencentes a vários grupos químicos, arrastáveis pelo vapor de água, praticamente insolúveis na água mas solúveis nos solventes orgânicos e nas gorduras (Cunha et al., 2007).

Dada a importância da cultura do tomateiro em Portugal e sabendo-se que, de entre os factores bióticos que conduzem a prejuízos nesta cultura (Cruz, 2010; Moura et al., 2004), se destacam as doenças causadas por bactérias, este trabalho teve como objectivo estudar as potencialidades antimicrobianas in vitro de Coriandrum sativum L., Origanum vulgar L. e Mentha pulegium L. relativamente às bactérias P. corrugata, P. mediterranea e P. syringae pv. tomato e como meio de protecção contra as doenças que estas bactérias causam no tomateiro, em comparação com o padrão oxicloreto de cobre.

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

Os extratos e óleos essenciais de C. sativum L. (coentro), O. vulgar L. (orégão) e M. pulegium L. (poejo) foram fornecidos, em parte, pelo Departamento de Fisiologia Vegetal (INRB L-INIA) e outra parte (coentro), produzidos de acordo com o modo de produção biológico, na quinta pertencente à associação de pais e amigos de crianças inadaptadas, em Barcelos. No caso dos extratos e óleos essenciais de orégão e poejo, foram também utilizadas formulações antibacterianas comerciais (produzido de acordo com o modo produção biológico). Para a obtenção de extratos e óleos essenciais de poejo, foram ainda colhidas plantas numa área de vegetação espontânea, localizada na freguesia de Anjo do concelho de Vieira do Minho. O material vegetal colhido, folhas, flores e sementes, foi seco à sombra, em local arejado e à temperatura ambiente, moído manualmente antes de proceder à preparação das diferentes formulações obtidas por diferentes métodos de extracção e testados em diferentes concentrações (Quadro 1). Os extratos etanólicos foram obtidos por contacto com o solvente, enquanto os óleos foram obtidos por arrastamento de vapor em Clavanger.

 

Os extratos aquosos de O. vulgare foram obtidos a partir de 100 g de material vegetal (sumidades de orégãos) em 500 mL de água destilada, por maceração a frio durante 24 horas, à temperatura ambiente e em escuro, e a quente, por fervura durante 20 minutos e repouso durante 3 horas. Os extratos foram concentrados num evaporador rotativo sob vácuo (Quadro 2).

 

Os extratos etanólicos e óleos essenciais foram obtidos a partir de C. sativum, O. vulgar e M. pulegium. Os extratos etanólicos foram obtidos de modo semelhante ao descrito para o extrato aquoso a frio e os óleos essenciais foram obtidos por arrastamento de vapor, em Clavager, conforme descrito por Barros et al. (2011).

Estirpes bacterianas, meios de cultura e inoculação

Foram selecionadas três bactérias patogénicas do tomateiro, duas bactérias responsáveis pela medula negra do tomateiro, P. corrugata (estirpe A344)e P. mediterranea (estirpe A54) isoladas em Portugal (Moura, 2005) e a estirpe tipo de P. syringae pv. tomato (LMG 5039). Os meios de cultura foram, respectivamente, LPGA e King B e a temperatura de incubação de 28ºC.

Acção antibacteriana d e extratos vegetais e óleos essenciais in vitro

Para o estudo de actividade antibacteriana in vitro, foram utilizadas culturas puras com 24 horas de crescimento das estirpes referidas. Prepararam-se suspensões bacterianas cuja concentração foi ajustada a 10⁸ ufc ml^-1. Placas, com meio de cultura apropriado, foram inoculadas com 100 µl de cada suspensão bacteriana. Após 24-48 horas, os extratos aquosos e etanólicos foram aplicados em orifícios no agar (10 mm Ø), duas doses por placa (Quadros 3 e 4). Por cada modalidade foi preparada a testemunha só com água esterilizada. Os ensaios com os óleos essenciais foram realizados por difusão em discos de papel (5 mm Ø), colocados sobre a superfície do meio de cultura, em placas preparadas como anteriormente descrito. Tanto os extratos como os óleos foram testados na inibição de P. corrugata-A344, P. mediterranea-A54 e P. syringae pv. tomato -LMG 5039. Cada ensaio foi realizado em triplicado.

 

A actividade antibacteriana foi avaliada com base no diâmetro do halo de inibição do crescimento bacteriano, após incubação a 28ºC, até uma fase de crescimento exponencial. Os dados foram analisados utilizando o software SPSS 12.0. Quando os pressupostos da ANOVA foram verificados, efectuou-se a análise da variância e as médias dos halos de inibição foram comparados pelo teste da diferença mínima significativa (LSD). Os testes estatísticos de Mann-Whitney foram utilizados quando não se verificaram os pressupostos necessários à realização da ANOVA.

]]> Acção antibacteriana in planta - ensaio em estufa

Uma parte do trabalho experimental decorreu numa estufa com cobertura de polietileno, pertencente à Associação de Pais e Amigos de Crianças Inadaptadas do concelho de Barcelos, durante Agosto a Outubro de 2010. Plantas de tomateiro da cultivar Marmande com 20 dias, obtidas por sementeira, foram transplantadas para vasos de 10 litros de capacidade. Após 3 dias, quando as plantas apresentavam 8 a 9 folhas, procedeu-se à sua pulverização até ao ponto de escorrimento (Balestra et al., 2009) com os extratos etanólicos (5 mg ml^-1) e óleos essenciais (0,1%) de coentro, orégão e poejo, no volume de 25 mL por planta. Como padrão, as plantas foram pulverizadas com oxicloreto de cobre (2,5 g l^-1). O estudo relativo à doença da pinta negra do tomateiro (P. syringae pv. tomato) decorreu na estufa de polietileno pertencente à ESAPL, durante Setembro a Novembro de 2011, tendo-se utilizado plantas de tomateiro da cultivar Coração de Boi. O ensaio decorreu em vasos e a metodologia utilizada para pulverização dos tomateiros foi a já descrita para a cultivar Marmande.

Produção de inóculo e inoculação de tomateiros

As suspensões utilizadas (10⁸ ufc ml^-1) para inoculação de tomateiros foram preparadas a partir de culturas bacterianas com 24 horas de crescimento a 28 ºC, em meio LPGA e King B de acordo com procedimento descrito previamente. Após 72 horas, procedeu-se à inoculação dos tomateiros com as estirpes A344 de P. corrugata, A54 de P. mediterranea e LMG 5039 de P. syringae pv. tomato. Pelo facto de P. corrugata-A344 e P. mediterranea-A54 serem bactérias que colonizam a medula do tomateiro e os tecidos vasculares da planta, manifestando os sintomas típicos da doença no interior do caule, os tomateiros foram inoculados por injecção no caule, utilizando 0,5 ml de cada suspensão bacteriana (Moura, 2005). A inoculação de P. syringae pv. tomato foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Balestra et al. (2009), pulverizando uniformemente as folhas de tomateiro com 1,5 ml de inóculo por planta.

Como testemunha, o mesmo número de plantas foi inoculado com água destilada esterilizada, tendo-se inoculado, no total, 96 plantas. Após a inoculação, os tomateiros foram regados e cobertos, durante 2 dias, com o filme de polietileno transparente, para criar condições favoráveis à infecção das plantas. Por cada tratamento (espécie vegetal, extrato/óleo essencial) ou estirpe bacteriana, utilizaram-se 4 plantas (uma planta por vaso).

Avaliação da acção antibacteriana de extratos vegetais e óleos essenciais em plantas de tomateiro

O efeito da aplicação de extratos etanólicos e óleos essenciais de coentro, orégão e poejo na severidade da doença da medula negra, causada por P. corrugata e P. mediterranea (ensaio 1) foi avaliado 60 dias após a inoculação dos tomateiros, através da observação dos sintomas internos e da medição do comprimento da lesão total (cm) no interior do caule, desenvolvida a partir do ponto de inoculação. O efeito da aplicação de extratos etanólicos e óleos essenciais de coentro, orégão e poejo na doença da pinta negra do tomateiro, causada por P. syringae pv. tomato (ensaio 2) foi avaliado 15 dias após inoculação das folhas, através da observação e registo da presença de lesões típicas na sua superfície. A incidência da doença (ID) foi determinada pelo número de folíolos com sintomas por cada planta inoculada e a severidade da doença (SD) foi determinada pelo número de necroses por folíolo por cada planta inoculada.

O delineamento experimental (ensaio 1) consistiu num ensaios em vasos com 4 blocos causalizados e 24 tratamentos diferentes, resultantes da seguinte estrutura fatorial com 3 fatores:

Fator 1: espécies vegetais com 3 níveis (coentro, orégão e poejo);

Fator 2: espécies bacterianas com 2 níveis: P. corrugata e P. mediterranea);

]]> Fator 3: formulações antibacterianas com 4 níveis [extratos etanólicos, óleos essenciais, oxicloreto cobre (padrão) e água (testemunha)].

O ensaio 2 foi idêntico, tendo o fator 2, apenas 1 nível: P. syringae pv. tomato.

Os dados foram analisados utilizando o software SPSS 12.0. Efetuou-se a análise de variância e as médias das populações foram comparadas pelo teste da diferença mínima significativa (LSD).

A classificação toxicológica e ecotoxicológica do oxicloreto de cobre apresentam-se no Quadro 3.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Extratos aquosos

Os resultados dos testes de ação antibacteriana in vitro, são apresentados nas Figuras 1, 2 e 3. Não se observaram diferenças significativa entre os resultados dos extratos obtidos a frio e a quente para qualquer das espécies. Após aumento da concentração (76,6 mg ml^-1 na formulação obtida a quente e 157,43 mg ml^-1 na formulação obtida a frio), evidenciou-se a actividade do extrato de orégão obtido a quente (Figura 1), tendo P. syringae pv. tomato apresentado halos de inibição significativamente maiores (p< 0,05) do que os observados nas estirpes A344 de P. corrugata e A54 de P. mediterranea. O aumento da concentração do extrato aquoso de orégão a frio, revelou alguma atividade inibitória consistente 48 horas após incubação apenas no caso das bactérias P. mediterranea e P. syringae pv. tomato.

 

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Os extratos aquosos de orégão obtidos a quente na dose de 250 µl inibem o crescimento das 3 bactérias, 48 horas após incubação. As inibições bacterianas mais significativas verificaram-se a quente, sobretudo sobre P. syringae pv. tomato, 48 horas após incubação (20, 87±4,26mm).

Extratos etanólicos

A atividade antibacteriana dos extratos etanólicos de coentro, orégão e poejo (Figura 2a), expressa a significância dos resultados observados. Das 3 espécies de plantas utilizadas, conclui-se que os extratos etanólicos de coentro são os que têm maior actividade biológica in vitro, excepto contra a bactéria P. syringae a qual foi também 100% inibida com os extratos de orégão e de poejo.

A bactéria P. syringae pv. tomato foi a mais sensível à acção dos extratos etanólicos de orégão e poejo. Não se registaram diferenças significativas entre as bactérias com a aplicação do extrato etanólico de coentro. Contrariamente, a utilização de orégão e poejo, inibiu de forma significativamente diferente o crescimento das estirpes A344 de P. corrugata, A54 de P. mediterranea eLMG 5039 de P. syringae pv. tomato.

Óleos essenciais

A actividade antibacteriana dos óleos essenciais testados quanto às suas potencialidades de inibição do crescimento in vitro das bactérias P. corrugata, P. mediterranea e P. syringae pv. tomato evidencia a maior susceptibilidade de P. syringae relativamente aos diferentes óleos essenciais, sendo P. mediterranea a menos susceptível (Figura 2b).

Actividade antibacteriana in planta

A análise dos resultados obtidos no estudo de bioactividade de extratos etanólicos e óleos essenciais, obtidos in planta sobre P. corrugata e P. mediterranea (Figura 3 e Quadro 4) evidenciou que a doença causada por estas duas espécies bacterianas traduziu-se, em média, por lesões de 2,21 ± 1,43 cm, e 3,21 ± 2,08 cm, respectivamente. A severidade da doença causada por P. corrugata-A344 e P.mediterranea-A54, referida nas Figura 3a e 3b mostra que não houve diferenças significativas entre as espécies bacterianas, quando submetidas à aplicação dos de extratos etanólicos , óleos essenciais e oxicloreto de cobre, não existindo interação entre as diferentes formulações antibacterianas e as duas espécies bacterianas (Figura 3a). As plantas testemunha, pulverizadas apenas com água, sofreram danos por infecções criptogâmicas, que por terem interferido no crescimento dos tomateiros foram excluídas desta análise.

Apesar dos sintomasda doença causada pelas bactérias P. corrugata e P. mediterranea terem sido idênticas às referidas por outros autores (Lopez et al., 1994; Moura, 2005), a severidade da doença foi claramente inferior à descrita em estudos realizados com as mesmas estirpes bacterianas na região de Ponte de Lima (Moura et al., 2005). Este facto poderá ser justificado pela suscetibilidade das cultivares, e devido à época do ano em se realizaram os diferentes ensaios em estufa.

Os resultados do estudo de bioactividade obtidos in planta sobre P. syringae pv. tomato (estirpe LMG 5039) não mostram diferenças significativasda incidência da doença (Figura 4 e Quadro 5. A severidade com que a doença se manifestou também não registou qualquer diferença entre os tomateiros pulverizados com os extratos etanólicos, óleos essenciais ou oxicloreto de cobre (padrão) e os tomateiros inoculados sem qualquer tratamento (testemunha).

 

 

 

CONCLUSÃO

]]> Os ensaios realizados in vitro, mostram que os extratos aquosos e etanólicos, e os óleos essenciais obtidos a partir de C. sativum, O. vulgar e M. pulegium apresentam actividade antimicrobiana, inibindo o crescimento de P. corrugata, P. mediterranea, P. syringae pv. tomato, bactérias patogénicas do tomateiro. A actividade antibacteriana de Mentha pulegium contra os agentes responsáveis da medula negra do tomateiro (P. corrugata e P. mediterranea) e da doença da pinta negra(P. syringae pv. tomato) foi demonstrada pela primeira vez.

Nos ensaios realizados in planta, os extratos etanólicos e os óleos essenciais de coentro, orégão e poejo conduziram a resultados não concordantes com os obtidos in vitro. Nas condições experimentais, e no caso da doença da medula negra do tomateiro, a pulverização de tomateiros com extratos etanólicos e óleos essenciais de coentro, orégão e poejo, teve efeito idêntico ao obtido com o padrão oxicloreto de cobre, podendo ser alternativa a este composto de cobre.

 

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