Glyphosate resistance survey on Conyza Canadesis

Simão Mendes^[1], João Portugal^[1] e Isabel Calha^[2]

^[1] IPB, Escola Superior Agrária de Beja. E-mail: jportugal@ipbeja.pt e simoonmendes@gmail.com

^[2]INRB I.P. Laboratório Nacional de Investigação Agrária (INIA) Unidade de Investigação de Protecção de Plantas Quinta do Marquês 2784-505 Oeiras. E-mail: isabel.calha@inrb.pt

RESUMO

O glifosato é o herbicida mais importante a nível nacional, utilizado principalmente para controlar infestantes em culturas perenes e em zonas não cultivadas. É considerado um herbicida de elevado risco de resistência. Em Portugal foi recentemente confirmada a resistência em Conyza bonariensis, em olival intensivo. Neste trabalho apresentam-se os resultados da prospecção realizada para despistagem de resistência ao glifosato em populações de Conyza canadensis. Para confirmação da resistência, realizaram-se ensaios de dose-resposta com planta inteira. Obtiveram-se valores de ED₅₀ entre 32,72 g.ha^-1 na população susceptível e 77,91 g. ha^-1na população mais resistente, permitindo obter níveis de resistência (NR=ED₅₀R/ED₅₀S) ao glifosato de 2 para todas as populações. Os valores de NR superiores à unidade parecem traduzir a tendência de todas as populações apresentarem resistência ao glifosato. Estes resultados serão confirmados em ensaios de laboratório para determinação do mecanismo de resistência.

Palavras - chave:Ensaio de dose-resposta, olival.

ABSTRACT

In Portugal, glyphosate is widely used for weed control on perennial crops and non-cropping areas. It is considered an herbicide of high risk of resistance worldwide. Glyphosate resistance in Portugal was recently confirmed in Conyza bonariensis populations from intensive olive groves. This paper presents the results of a survey conducted for detecting glyphosate resistance in populations of Conyza canadensis. Whole plant dose-response bioassays were conducted to confirm resistance. ED₅₀ values ranged from 32.72 g.ha^-1 in susceptible population to 77.91 g.ha^-1 for the most resistant population. The resistance factor (RF = ED₅₀R/ED₅₀S) was around 2 for all populations. These values reflect a trend that all populations studied were resistant to glyphosate and laboratory tests to determine the mechanism of resistance are in course.

Keywords:dose-response bioassays, olive grove.

INTRODUÇÃO

O cultivo intensivo do olival, com recurso à rega e maior densidade de plantação, conduz a maior pressão dos organismos fitopatogénicos sobre a cultura e a maiores exigências da cultura no que respeita à sua nutrição. Tem-se verificado, por um lado, o incremento de pragas e doenças nos olivais regados, o que conduz a uma aplicação crescente de produtos fitofarmacêuticos (insecticidas e fungicidas) e no que respeita ao controlo das infestantes, a progressiva substituição de herbicidas persistentes por herbicidas não selectivos, não residuais, e, por isso, considerados com risco mais aceitável para o ambiente, de que é exemplo o glifosato. No entanto, a sua aplicação repetida não está isenta de riscos. E, se, por um lado, provoca menores riscos de contaminação do solo e água do que outros herbicidas, acarreta riscos para a diversidade biológica ao seleccionar populações de plantas infestantes resistentes, que o herbicida já não controla. A nível mundial conhecem-se 21 espécies com resistência ao glifosato, correspondentes a mais de 99 populações diferentes (Powles, 2008; Heap, 2011). Este fenómeno relativamente recente, tem já exemplos na Península Ibérica em olivais da Andaluzia, onde a repetida aplicação de glifosato seleccionou resistência em Conyza spp. e em Lolium spp. (Urbano et al., 2005 e 2007; Martinez e Urbano, 2007; Cruz-Hipólito et al., 2007). Em Portugal, a ocorrência de populações de Conyza bonariensis resistentes ao glifosato foi confirmada, em 2010 e trata-se do primeiro caso de resistência a este herbicida no país (Calha e Osuna, 2010).

O glifosato pertence à família química dos aminoácidos, sendo um herbicida não selectivo de aplicação foliar, com elevada sistemia na planta. Depois de aplicado é absorvido pelas folhas e rapidamente translocado para os ápices vegetativos (meristemas) onde vai exercer a acção herbicida. Tem um modo de acção único, actuando na biossíntese dos aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina e triptofano, inibindo a actividade da enzima 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase (Steinrücken e Amrhein, 1980). O glifosato é o herbicida mais vendido, a nível mundial e nacional (Abreu, 2011) e está recomendado para controlar infestantes anuais e vivazes em culturas perenes durante o ciclo vegetativo e antes da instalação ou plantação, em culturas anuais. No mercado nacional, encontra-se formulado em herbicidas simples e mistos. A sua eficácia depende da dose e condições de aplicação, nomeadamente do estado de desenvolvimento das infestantes, na altura da aplicação.

O glifosato é um herbicida não selectivo que controla eficazmente largo espectro de infestantes anuais e perenes, incluindo as diferentes espécies de Conyza. Em Portugal, estão identificadas 3 espécies: Conyza canadensis (L.), Cronq. (avoadinha), C. sumatrensis (Retznis) Walker (ex Conyza alba Sprengel, (avoadinha–marfim) e C. bonariensis (L.) Cronq. (avoadinha-peluda). Também é referida a eventual presença de híbridos: C. x rouyana Sennen (C. albida x canadensis) e C. x mixta Fouc. e Neyr. (C. bonariensis x canadensis) (Franco, 1984).

Conyza canadensis é uma espécie originária da América do Norte, considerada invasora, mas naturalizada em Portugal. Encontra-se distribuída por todo o país, afectando numerosas culturas anuais e perenes e zonas não cultivadas. É uma planta anual diplóide (2n=18) heterogâmica da família botânica Asteraceae. A espécie produz elevado número de sementes (2000 a 230.000 por planta) de reduzida persistência (longevidade de 2-3 anos), pelo que não constitui um banco de sementes persistente no solo (Weaver, 2001). É uma espécie de Primavera-Verão, podendo ser anual ou bienal, consoante as espécies. A luz é essencial para a germinação das sementes de Conyza. De facto, não germinam sementes enterradas entre 2-6 cm de profundidade. Germina na Primavera e passa o Inverno sob a forma de roseta, só produzindo flores e fruto no 2º ano. O fruto é uma cipsela, cuja configuração permite a fácil dispersão a longas distâncias.

MATERIAL E MÉTODOS

A espécie Conyza canadensis

A identificação das espécies de Conyza spp. presentes nos olivais suspeitos de resistência foi realizada com exemplares de planta inteira, colhidos no campo (Franco, 1984). A amostragem de sementes de plantas de Conyza canadensis decorreu nos meses de Agosto e Setembro de 2010 (Quadro 1) em 7 olivais do distrito de Beja, onde se registaram queixas de falta de eficácia do glifosato quando aplicado na dose recomendada. A população susceptível (S) proveniente de um olival não tratado da mesma região foi utilizada como padrão.

 

Ensaios de germinação

Procedeu-se à determinação da capacidade germinativa das sementes de cada população. As sementes foram colocadas a germinar em placa de Petri de PVC, de diâmetro 10 cm, contendo agar (KNO₃ 0,2%). Os ensaios de germinação decorreram em câmara de incubação Cassel CBT em condições de alternância de temperatura e luz: 20/25ºC (± 1ºC) e 12 h fotoperíodo (Karlssen e Milberg, 2007) e tiveram a duração de 15 dias. Cada população correspondia a 50 sementes por placa e 4 repetições.

Características toxicológicas e ecotoxicológicas do glifosato

]]> O glifosato, pelo seu modo de acção, não é tóxico para mamíferos (não apresenta toxidade aguda, não é cancerígeno, mutagénico nem tóxico para a reprodução). Está classificado como irritante. Apresenta baixo risco de lixiviação; porque apesar da elevada solubilidade em água (11 600 mg L^-1) é pouco móvel no solo (Koc 884 a 60 000). A contaminação de águas subterrâneas é pouco provável, por ser rapidamente degradado por via microbiólogica (DT₅₀=38-60 d) em AMPA (ácido aminoetilfosfónico) e por se manter fortemente ligado ao complexo argilo-húmico do solo. O risco de contaminação das águas superficiais é baixo, mas pode causar efeitos a longo prazo no meio aquático: sendo moderadamente tóxico para peixes e invertebrados aquáticos; não apresenta toxicidade para outros organismos não visados, designadamente abelhas, algas, e minhocas. (Dill et al., 2010; CE, 2011).

Ensaio de dose-resposta

Para a confirmação de resistência ao glifosato adoptou-se o procedimento recomendado por HRAC (1999) e Heap (2005). As sementes foram colocadas à superfície de substrato saturado e o tabuleiro envolvido em papel de jornal para manutenção da humidade e luz (Lazarotto et al., 2008). Plântulas com uma folha verdadeira (BBCH 11) foram transplantadas para vasos de PVC de 7 cm de diâmetro e 10 cm de profundidade (2-4 plântulas por vaso), com substrato de terra:turfa:areia (2:1:1) (18,9% areia, 58,8% limo, 22,3% argila, pH 7.4 e m.o. 2.2%), adubado com BLAUKORC (20 g v/v). A rega foi efectuada por subirrigação, quando necessária. Considerando que a susceptibilidade das plantas de Conyza spp. ao herbicida glifosato, depende da temperatura (Urbano et al., 2007; Kleinman et al., 2011), o ensaio decorreu em câmara climatizada (Fitoclima 1500 I – AraLab), com alternância de temperatura e luz 25/20ºC, 12 h de luz -550 µmolm^-2s^-1 (Dinelli et al., 2006).

Procedeu-se à aplicação de glifosato (RoundUp, 360 g s.a.L^-1, SL, Monsanto) numa gama de 6 doses de glifosato, incluindo a testemunha, na escala logarítmica (0, 45, 90, 180, 720, e 1440 g ha^-1) (Dinelli et al., 2008). O herbicida foi aplicado com um OPS (Oxford Precision System) calibrado para aplicar 200 L ha^-1 herbicida (275 kPa) As plantas de C. canadensis tinham 2-4 folhas (BBCH 12-14).

O peso verde e a percentagem de sobrevivência foram determinados 21 dias após a aplicação (DAA). As plantas com o meristema apical necrótico eram consideradas mortas. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 4 repetições. O ensaio foi repetido e os resultados foram combinados.

Os resultados obtidos foram submetidos a análise de variância (ANOVA) e transformados (arcsin) para obedecerem aos pressupostos da normalidade. Ajustou-se um modelo de regressão não-linear (Seefeldt et al., 1995; Knezevic et al., 2007) às curvas de dose-resposta que permitiram estimar o valor de ED₅₀ para cada população.O modelo do tipo logístico com 4 parâmetros tinha a seguinte expressão:

em que y corresponde ao peso verde das plantas de C. canadensis (g) e x à dose de herbicida (g ha^-1). Uma das vantagens da curva descrita pela expressão (1) é que os parâmetros utilizados no modelo têm um significado biológico. Assim, d, corresponde à assíntota superior da curva de dose-resposta, i.e., ao peso verde (g) obtido na dose mais reduzida de herbicida; c, à assíntota inferior da curva de dose-resposta, i.e., ao peso verde (g) obtido na dose mais elevada de herbicida; b, ao declive da curva de dose-resposta obtido ao nível do valor de ED₅₀ (dose que provoca a redução de 50% do peso verde relativamente à testemunha).

 

RESULTADOS

]]> Ensaio de germinação

A espécie Conyza canadensis não apresentou período de latência e a germinação foi rápida, atingindo a capacidade germinativa (CG) ao fim de 17 dias. A capacidade germinativa das populações de C. canadensis variou entre 42% e 84,5%. As populações B1 e B5 tiveram de ser descartadas nos primeiros ensaios pela baixa CG. Procedeu-se a nova colheita de amostras para tentar obter sementes com grau de maturação mais elevado. Segundo a bibliografia esta espécie não apresenta dormência, tendo apenas a luz como factor limitante da germinação (Baskins e Baskins, 1998).

Ensaio de dose resposta

Os ensaios decorreram de Novembro de 2010 a Janeiro de 2011. Verificou-se o aumento da mortalidade das plantas com o aumento da dose na população susceptível. Na dose de 180 g ha^-1, registou-se a taxa de mortalidade de 25%, seguida de 50% para as doses de 360 e 720 g ha^-1 e 100% nas doses mais elevadas. Pelo contrário, nas outras populações, registaram-se taxas de mortalidade entre 25% e 50% apenas na dose mais elevada, para as populações B2, B4 e B6.

A resposta das populações de C canadensis, a doses crescentes de glifosato, expressa em peso verde, foi diferente entre as populações, seguindo uma curva logística (Figura 1). Os valores de ED₅₀ obtidos variaram entre 32,72 g ha^-1 na população susceptível (S) e 77,91 g ha^-1 na população mais resistente (B4) permitindo obter níveis de resistência (NR) ao glifosato de 2 para todas as populações; o que significa que, na prática será necessário aplicar o dobro da dose de glifosato para controlar as populações resistentes (Quadro 2).

 

 

 

Os valores de NR superiores à unidade parecem traduzir a tendência de todas as populações estudadas apresentarem resistência ao glifosato. Estes resultados poderão ser confirmados nos ensaios de laboratório a realizar posteriormente, para determinação do mecanismo responsável pela resistência.

]]> Os NR ao glifosato são relativamente baixos em Conyza spp., não atingindo valores superiores a 2 para C. bonariensis e entre 7 e 10 para C. canadensis (Leon et al., 2005; Kleinman et al., 2011). Estes valores dependem do mecanismo bioquímico responsável pela resistência. O mecanismo mais frequente em dicotiledóneas é a perda de sistemia do glifosato nos biótipos resistentes (Dinelli et al., 2006 e 2008). Recentemente foi identificado um biótipo de C. sumatrensis R ao glifosato com NR de 60. Este valor excepcional está associado à ploidia e à mutação no gene que codifica a enzima alvo do glifosato EPSP sintase (Gonzalez-Torralva et al., 2011).

 

CONCLUSÃO

Confirmação de resistência ao glifosato em 3 populações de avoadinha (Conyza canadensis), infestante de olivais intensivos do Baixo Alentejo.

 

AGRADECIMENTOS

A Leonor Cruz, Ana Neves e Mª Lurdes Silva do LINIA_INRB I.P. pela cedência de espaço no Fitoclima e a disponibilidade e dedicação na manutenção dos ensaios.Este estudo foi parcialmente financiado pelo projecto PRODER - REMDA Olival.

 

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