Trichoderma in vitro control of fungi present in diaspores of Gochnatia polymorpha

Daniele Franco Martins Machado e Antonio Carlos Ferreira da Silva

* Departamento de Biologia, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Avenida Roraima, n. 1000, CEP 97119-970, Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brasil. E-mail: danifmartins@gmail.com, author for correspondence, acfsilva2@uol.com.br

RESUMO

Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de isolados e produtos biológicos de Trichoderma spp. no controlo in vitro de fungos presentes nos diásporos de Gochnatia polymorpha. Foram avaliados, pela técnica de confrontação direta, os isolados TSM1, TSM2, 2B2 e 2B22 e os produtos Trichodermil® e Agrotrich® no antagonismo a fungos dos gêneros Bipolaris, Alternaria, Cladosporium e Phoma, isolados dos diásporos. O efeito de trichoderma na contaminação fúngica dos diásporos foi avaliado pela técnica do papel celofane utilizando-se como meio de cultura ágar-água + BD (batata dextrose). Também se estudou o efeito na germinação das sementes. O isolado 2B22 e o produto Agrotrich® são os mais eficientes no antagonismo aos fungos testados e todos os trichodermas avaliados são eficientes no controlo in vitro da contaminação fúngica dos diásporos. A adição de BD ao meio ágar impede a germinação das sementes, impossibilitando avaliar o efeito dos metabólitos de trichoderma nesse processo.

Palavras-chave: Bioagente, cambará, espécie florestal, interação planta-microrganismo

The effect of isolates and biological products of Trichoderma spp. in vitro in control of fungi present in diaspores of Goch­natia polymorpha was evaluated in this study. The use of direct confrontation technique, the TSM1, TSM2, 2B2 and 2B22 isolated and the Trichodermil® and Agrotrich® products were also studied in antagonism of fungi belonging to Bipolaris, Alternaria, Cladosporium and Phoma genera, which were isolated from diaspores. We have studied the effect of fungal contamination in trichoderma diaspores using the technique of cellophane and water-agar + BD (potato dextrose) as culture media. We also studied the effect on seed germination. The 2B22 isolated and the Agrotrich® product are the most effective in the antagonism of the fungi tested, and all evaluated trichodermas are effective in vitro control of the fungi diaspores contamination. The addition of BD to agar medium precludes the germination of seeds. This makes impossi­ble to evaluate the effect of metabolites from trichoderma in this process.

Keywords: Bioagent, cambaraforest, species, plant-microorganism interaction

Introdução

A interação entre plantas e microrganismos é uma alternativa sustentável, pesquisada e aplicada em diversas culturas agrícolas (Altomare et al.,1999). Esta técnica vem sendo amplamente utilizada em pesquisas de instituições de ensino e centros de pes­quisa, sendo que alguns microrganismos têm sido relatados no controlo biológico de fitopatógenos, na promoção da germinação de sementes e no cresci­mento vegetal de diferentes culturas, com sucesso comprovado e outros com potencial de uso (Melo, 1998; Hoyos-Carvajal, et al., 2009).

Dentre os antagonistas utilizados no biocontrolo de fungos fitopatogênicos, cerca de 90% têm sido reali­zados com diferentes isolados pertencentes ao gêne­ro Trichoderma (Benítez et al., 2004; Kunieda-Alonso et al., 2005). Diferentes isolados têm levado a aumen­tos significativos na percentagem e na precocidade de germinação (Melo, 1996), além do aumento no crescimento de plantas e na produtividade de cul­turas inoculadas com esse bioagente, como milho, feijão, arroz, ervilha, grão-de-bico, pepino, berinjela, pimentão, rabanete, tomate, alface, cenoura, cravo, crisântemo, algodão, entre outras (Almança, 2005; Gravel et al., 2007; Harman et al., 2004b; Hoyos­-Carvajal et al., 2009; Jyotsna et al., 2008; Luz, 2001; Resende et al., 2004; Yedidia et al., 2001).

Espécies do gênero Trichoderma, conhecidas popu­larmente por trichoderma, compreendem fungos de vida livre, que se reproduzem assexuadamente, presentes com mais frequência em solos de regiões de clima temperado e tropical. Muitas linhagens não possuem ciclo sexual conhecido (Harman et al., 2004a), sendo classificadas na sub-divisão Deute­romycotina e são caracterizadas pela produção de conídios ou por fragmentação do talo micelial (Kru­ger e Bacchi, 1995).

Os isolados de trichoderma são utilizados no contro­lo biológico de fitopatógenos e na promoção de cres­cimento vegetal devido a sua versatilidade de ação, como parasitismo, antibiose e competição; além de atuarem como indutores de resistência a plantas contra doenças e produzirem hormônios (hormo­nas) de crescimento. Essas características tornam­-nos os fungos mais pesquisados em condições de laboratório, estufa e a campo (Altomare et al., 1999; Delgado et al., 2007; Carvalho-Filho et al., 2008; Har­man, 2000; Hoyos-Carvajal et al., 2009; Louzada et al., 2009; Resende et al., 2004). Além disso, há deze­nas de produtos à base de trichoderma disponíveis no mercado para comercialização (Lopes, 2009).

No Brasil, para a produção e o cultivo de mudas florestais, várias dificuldades são encontradas. En­tre estas dificuldades está o pequeno número de árvores matrizes disponíveis em populações natu­rais, que se encontram extremamente fragmentadas, o que resulta na falta de sementes com qualidade adequada, por terem baixo poder germinativo e alto índice de fungos associados às sementes. Acresce a estas dificuldades o facto de algumas espécies apre­sentarem crescimento lento (Caldas, 2006; Carneiro, 1987; Silva e Higa, 2006). Esses, dentre outros fato­res, acabam prejudicando o cultivo das mudas e fa­zem com que estas sejam comercializadas com baixa qualidade e alto custo.

G. polymorpha produz anualmente grande quanti­dade de frutos do tipo cipsela, caracterizados pela ocorrência de uma semente presa à sua parede por um só ponto. Os frutos são a unidade de dispersão da espécie, denominada diásporo, sendo a sua prin­cipal forma de dispersão, a anemocoria. Contudo, apesar da grande produção anual de frutos, o poder germinativo das sementes é baixo, e o crescimento das mudas é lento a moderado (Carvalho, 2003).

O mercado consumidor de sementes e mudas flores­tais tem aumentado consideravelmente nos últimos 20 anos, devido ao crescente interesse econômico, e mais recentemente, pela preocupação conservacio­nista em recuperar áreas intensamente devastadas (Figliolia et al., 2007). No entanto, esse processo tem sido dificultado pelos problemas enfrentados na produção de mudas, sendo que o desenvolvimen­to de técnicas silviculturais, como a interação entre plantas e microrganismos, é uma alternativa susten­tável para controlar biologicamente os fungos pre­sentes nas sementes/diásporos e estimular a germi­nação e o crescimento vegetal. No entanto, para a maioria das espécies florestais, esta é uma alternati­va muito carente (Caldas, 2006).

Embora em vários estudos se tenha observado a ação positiva de isolados de trichoderma, existem poucos relatos de pesquisas envolvendo a interação desses bioagentes e espécies arbóreas (Donoso et al., 2008), sendo que os resultados desta interação po­derão otimizar a produção de mudas para os mais diversos interesses, através do controlo biológico de fungos associados aos diásporos e da promoção da germinação das sementes.

Isolados de Trichoderma spp. têm sido estudados por produzirem uma série de enzimas extracelu­lares (Menezes e Souza, 1995). Estão neste caso as que degradam celulose e quitina, que são utiliza­das no antagonismo contra fungos patogênicos, por degradarem paredes de células fúngicas (Har­man et al., 2004a) e por serem ativos na produção de metabólitos com atividade microbiana (Melo, 1991). Estes metabólitos produzidos podem ser vo­láteis e não-voláteis (Bastos, 1991), sendo a técnica do papel celofane utilizada para selecionar agentes biocontroladores de fungos patogênicos, produto­res de metabólitos não-voláteis (Ethur et al., 2005; Silva, 1997).

Neste estudo, a técnica do papel celofane é apresen­tada como uma técnica nova para avaliar o efeito de metabólitos produzidos por agentes biocontro­ladores no controlo do desenvolvimento de fungos contaminantes associados às sementes, já que não foram encontrados registros da sua utilização para este fim. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o antagonismo e o efeito de isolados e pro­dutos biológicos à base de Trichoderma spp. no con­trolo, in vitro, dos fungos presentes nos diásporos de G. polymorpha pela técnica modificada do papel celofane.

Material e Métodos

Foram coletados ramos com infrutescências de G. polymorpha em janeiro de 2011, em uma população natural, no Distrito Boca do Monte, Santa Maria – RS, Brasil (29° 41’ 43,311’’S 53° 48’ 41,041’’O). As infrutescências secaram quatro dias a temperatura ambiente e após foi realizada a extração manual dos frutos (diásporos). Uma exsicata foi incorporada ao herbário do Departamento de Biologia do Centro de Ciências Naturais e Exatas da Universidade Federal de Santa Maria, sob o número de registro SMDB – 13.139.

As experiências foram realizadas no Laboratório de Interação Planta-Microrganismos/CCNE/UFSM. Foram utilizados dois isolados de Trichoderma viride, TSM1 e TSM2, dois isolados de Trichoderma harzia­num, 2B2 e 2B22, que estavam armazenados no mes­mo laboratório, além de dois produtos comerciais à base de trichoderma, Agrotrich® e Trichodermil®, que foram adquiridos junto dos respectivos fabri­cantes.

O teor de água dos diásporos foi determinado pelo método de estufa a alta temperatura (Brasil, 2009). Utilizaram-se quatro amostras de 1 g de diásporos, colocados em estufa à temperatura de 105ºC, com oscilações de ± 3ºC, durante um período de 24 ho­ras. Os resultados foram expressos em percentagem com base no peso úmido.

Com a técnica in vitro de confrontação direta foi observada a ação dos isolados de trichoderma no antagonismo aos fungos Bipolaris sp., Alternaria sp., Cladosporium sp. e Phoma sp., isolados previamente dos diásporos de G. polymorpha, mais quatro trata­mentos testemunha, contendo somente os fungos contaminantes.

Para isso, um disco de meio de cultura BDA (batata, dextrose e ágar), de 16 mm, contendo micélio e es­poros dos fungos contaminantes foi transferido para placas de Petri (9 cm de diâmetro), que continham meio de cultura BDA, a 1 cm da borda. O material foi incubado durante 48 horas, a 25°C com fotope­ríodo de 12 horas. Decorrido esse período, um dis­co de BDA, de 16 mm de diâmetro, com estruturas dos antagonistas foi transferido para as placas em posição oposta ao disco de micélio do patógeno. As placas foram mantidas em câmara climática do tipo Biosystem Organized Development (BOD) durante oito dias a 25°C, com fotoperíodo de 12 horas.

A avaliação foi realizada no oitavo dia, após a intro­dução dos antagonistas, baseada no critério de Bell et al. (1982), que adota uma escala de notas variando de 1 a 5. Critérios de avaliação: 1- antagonista cres­ce por toda a placa de Petri; 2- antagonista cresce e atinge uma parte do patógeno, cresce sobre 2/3 da placa; 3- antagonista e o patógeno crescem até a me­tade da placa, nenhum organismo domina o outro; 4- patógeno cresce e atinge uma parte do antagonis­ta, cresce sobre 2/3 da placa; 5- o patógeno cresce por toda a placa.

Também foi realizada uma avaliação aos 11 dias após a introdução do antagonista, a fim de se obser­var aqueles isolados que não apresentaram bom de­sempenho (notas entre 1 e 1,5) em oito dias. Foram avaliados 28 tratamentos dispostos no delineamen­to inteiramente casualizado, com quatro repetições por tratamento.

Trichoderma no controlo da contaminação dos diásporos e na germinação in vitro das sementes de G. polymorpha

Este ensaio foi realizado utilizando-se a técnica in vitro do papel celofane, de Ethur et al. (2005), modi­ficada neste trabalho, para ser empregada na avalia­ção do controlo da contaminação fúngica dos diás­poros de G. polymorpha por isolados de trichoderma. Também foi avaliada a percentagem de germinação in vitro das sementes. Foram utilizados quatro iso­lados de trichoderma, sendo TSM1 e TSM2 de T. vi­ride; 2B2 e 2B22 de T. harzianum, e os dois produtos comerciais, Trichodermil® e Agrotrich®, além dos tratamentos controlo, sem isolados de trichoderma.

O meio de cultura utilizado foi uma mistura de meio de cultura ágar-água e meio de cultura BD, sendo 70% ágar-água e 30% BD (batata e dextrose – 200 g de batata, 20 g de dextrose, 1000 mL de água destilada). Utilizou-se ágar 0,7% e pH ajustado a 5,8 ⁺ 0,2 em placas de Petri (9 cm de diâmetro). O meio de cultura foi coberto, assepticamente, com um dis­co de papel celofane semipermeável, esterilizado (120°C/40 minutos) e, para cima do papel celofane, no centro das placas, foram transferidos discos de 16 mm de meio de cultura à base de aveia (40 g de aveia, 20 g de ágar e 1000 mL de água destilada) contendo micélios e esporos dos isolados de tricho­derma. As placas dos tratamentos controlo foram cobertas com o disco de papel celofane, mas não re­ceberam o disco de micélio e esporos dos isolados. As placas foram vedadas com filme de PVC e as cul­turas mantidas em câmara climática do tipo BOD a 25°C e fotoperíodo de 12 horas por cinco dias.

Decorrido o período de incubação, em condições assépticas, as placas de Petri foram abertas e foi re­tirado o papel celofane juntamente com os discos de micélios e esporos, permanecendo no meio de cultu­ra apenas os metabólitos não-voláteis liberados pe­los isolados, onde foram semeados os diásporos de G. polymorpha (Figura 1), que previamente passaram por um processo de desinfestação, que consistiu na imersão por 15 minutos em solução de hipoclorito de sódio (NaClO) 2% acrescido de duas gotas de de­tergente líquido e três lavagens em água destilada e autoclavada.

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Além dos tratamentos com os isolados de tricho­derma, foram avaliados quatro tratamentos con­trolo, sendo que em dois deles utilizou-se meio de cultura ágar-água sem BD (Quadro 1). As culturas foram mantidas a 25°C com fotoperíodo de 16 ho­ras. As avaliações constaram da contagem dos diás­poros contaminados por fungos durante sete dias e da contagem das sementes germinadas por 25 dias, contados 24 horas após a instalação do experimento.

 

Foram avaliados dez tratamentos dispostos no de­lineamento inteiramente casualizado, com oito re­petições por tratamento; cada parcela experimental constituída por 25 diásporos, totalizando 200 por tratamento. Os dados em percentagem foram sub­metidos ao teste de Kruskal-Wallis pelo programa Action 2.2.

Resultados e Discussão

Os diásporos de G. polymorpha apresentaram teor de água de 7,23%. Resultados semelhantes foram en­contrados por outros autores em espécies relaciona­das. Teores entre 9 e 13% foram encontrados em di­ásporos de arnica (Lychnophora pinaster Mart.) (Melo et al., 2007) e 15% em camomila (Matricaria recutita L.) (Nóbrega et al., 1995), espécies pertencentes à mesma família de G. polymorpha.

Wielewicki et al., (2006), realizaram uma análise em dados de pesquisa do teor de água de sementes de 27 espécies florestais nativas do sul do Brasil e esta­beleceram que 21 das espécies estudadas apresenta­ram comportamento ortodoxo, ou seja, as sementes são tolerantes à perda de 90 a 95% de água duran­te o desenvolvimento e à dessecação (Castro et al., 2004); e teor de água médio entre 6,6 e 19,8%. Nesse sentido, os resultados encontrados no presente es­tudo permitem sugerir que os diásporos de G. poly­morpha são ortodoxos e o grau de umidade obtido está de acordo com a média encontrada em espécies relacionadas.

Antagonismo in vitro de trichoderma a fungos iso­lados dos diásporos de G. polymorpha

No pareamento de culturas, avaliou-se a ação dos isolados antagonistas, após oito e 11 dias da incor­poração destes. Os seis tratamentos com trichoder­ma demonstraram resultados variados no confronto in vitro com os fungos testados (Quadro 2).

 

Aos oito dias do teste, o isolado 2B22 e o produto Agrotrich® apresentaram ótimo desempenho no confronto aos quatro patógenos testados, obtendo notas entre 1 e 1,5 (Figura 2). Os isolados TSM1 e TSM2 também apresentaram ótimo desempenho no confronto com Alternaria sp., Cladosporium sp. e Phoma sp., com nota 1 em todos os tratamentos, mas não com Bipolaris sp., que obtiveram notas de 2 e 2,5, respectivamente. O isolado 2B2, aos oito dias, só ob­teve bom desempenho no confronto com Alternaria sp. e Cladosporium sp., com notas 1 para cada fungo contaminante.

 

Na segunda avaliação, realizada após 11 dias da incorporação do antagonista, observou-se que os isolados TSM1, TSM2 e 2B2 melhoraram seus de­sempenhos no confronto com Bipolaris sp., obtendo notas de 1,5; 1 e 1, respectivamente. O isolado 2B2, mesmo aos 11 dias, não foi tão eficiente no confron­to com Phoma sp., obtendo uma nota média de 1,75. O produto comercial Trichodermil® obteve bom de­sempenho (nota 1,5) aos 11 dias do teste no confron­to com Alternaria sp.

Os isolados de trichoderma demonstraram que pos­suem outras habilidades como agentes de biocon­trolo além da antibiose. A antibiose é definida como a interação na qual um ou mais metabólitos produ­zidos por um organismo têm efeito danoso sobre o outro (Stadnik e Bettiol, 2000), no entanto, segundo Bettiol (1991), uma característica recomendável, é que o antagonista aja através de mais de um meca­nismo, combinando antibiose, parasitismo, compe­tição e estímulo à defesa do hospedeiro.

No presente estudo, possivelmente ocorreu antibio­se, hiperparasitismo e competição. De acordo com Melo (1998), no ponto de encontro entre os dois mi­célios possivelmente ocorre antibiose e parasitismo, uma vez que trichoderma pode detectar e localizar hifas de fungos suscetíveis, crescendo em sua dire­ção. Além disso, segundo Howell (2003), espécies de trichoderma são hábeis na supressão do crescimento de vários fungos em meios de cultura contendo ágar, como observado no tratamento de segmentos de ra­ízes de feijoeiro infectadas com Macrophomina phase­olina e com T. virens, onde se observou que quando os segmentos foram plaqueados em meio com ágar, apenas T. virens cresceu a partir das raízes.

Os organismos competem entre si para obter nu­trientes, água, luz, espaço, fatores de crescimento, oxigênio, entre outros, sendo a competição um dos clássicos mecanismos de biocontrolo (Melo, 1996). Assim, o potencial hiperparasítico de trichoder­ma está relacionado com a competição por espaço e com atividades metabólicas que lhes permitem serem eficientes no hiperparasitismo das estrutu­ras de outros fungos (Harman, 2000). Contudo, os mecanismos de ação são características de cepas es­pecíficas, o que possivelmente explica as diferenças observadas no desempenho dos isolados.

Trichoderma no controlo da contaminação dos di­ásporos e na germinação in vitro das sementes de G. polymorpha

]]> A técnica do papel celofane é utilizada na seleção de microrganismos antagonistas produtores de compostos antifúngicos, como substâncias antibió­ticas ou metabólitos (Reis et al., 1995). A liberação de metabólitos não-voláteis e inibição no crescimento de fitopatógenos foram observadas por Silva (1997), que utilizou esse método e constatou que isolados de T. viride e T. harzianum foram efetivos quanto à inibição do crescimento micelial de Sclerotinia sclero­tiorum, um fungo causador de doenças. Ethur et al. (2005), também utilizaram essa técnica com o objeti­vo de selecionar agentes biocontroladores para esse mesmo patógeno.

O papel celofane, semi-permeável, permite a nutrição e crescimento do antagonista, além da difusão de me­tabólitos para o meio de cultura (Ethur, 2002), onde são inseridos discos contendo estruturas do patógeno. Neste experimento a técnica foi modificada, ao invés de se transferir para o meio de cultura discos do pató­geno, transferiram-se os diásporos de G. polymorpha, a fim de se avaliar o efeito de metabólitos liberados por isolados de trichoderma no controlo de fungos pre­sentes e na promoção de germinação das sementes.

Verificou-se que houve a liberação de metabólitos não-voláteis pelos isolados, através da coloração característica observada no meio de cultura (Figura 3) e das diferenças obtidas nas médias de conta­minações dos diásporos nos diferentes tratamentos (Quadro 3).

 

 

 

Observa-se no Quadro 3 que todos os tratamentos com trichoderma (T1 ao T6) inibiram o crescimento de fungos contaminantes, reduzindo as médias de contaminação quando comparadas às médias dos controlos 1 e 2 (T7 e T8). Embora os tratamentos com trichoderma não tenham diferido estatisticamente entre si, aqueles que apresentaram as menores mé­dias de contaminação foram TSM1 e TSM2 de T. vi­ride (2,5 e 4,5%, respectivamente), 2B22 de T. harzia­num (9,5%) e o produto comercial Agrotrich® (17%). Os tratamentos controlo 1 e 2 obtiveram uma média de contaminação de 93,5 e 100%, respectivamente, demonstrando que na ausência dos antagonistas a contaminação foi alta.

Os controlos 3 e 4 obtiveram uma média baixa de contaminação (36,50 e 6%, respectivamente). Nes­tes controlos utilizou-se meio de cultura água-água sem a adição de BD e a inclusão desses, neste expe­rimento, visou observar o comportamento dos di­ásporos em relação à promoção da germinação das sementes, assunto que será abordado adiante.

A diferença observada nas médias de contaminação, entre os isolados, também foi observada por Ethur (2002), porém no estudo da autora, os índices varia­dos entre os isolados foi em relação à inibição mi­celial do patógeno S. sclerotiorum. Hilgemberg et al. (2007), também observaram essa variação entre os antagonistas Trichoderma spp. e Trichotecium roseum, ao crescimento micelial de fungos de solo, S. scle­rotiorum, Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani e Fusa­rium sp. Essa variabilidade na ação dos antagonistas pode estar relacionada à produção dos metabólitos. Segundo Harman (2000), muitas espécies estudadas produzem metabólitos secundários tóxicos, como antibióticos e enzimas líticas capazes de inibir e destruir propágulos de fungos fitopatogênicos. De acordo com este autor, duas linhagens de T. harzia­num (T39 e NCIM1185) produzem uma protease que é capaz de degradar enzimas sintetizadas pelo patógeno Botrytis cinerea, demonstrando especifici­dade entre alguns isolados e o patógeno.

Mesmo não sendo possível avaliar o efeito dos iso­lados de trichoderma testados na promoção da ger­minação das sementes, a utilização da técnica do papel celofane modificada permitiu visualizar que os isolados apresentaram a propriedade do controlo biológico de fungos fitopatogênicos presentes nos diásporos de G. polymorpha, uma vez que, confor­me Vechiato (2010), espécies dos gêneros Bipolaris, Alternaria, Cladosporium e Phoma são consideradas potencialmente patogênicas às espécies florestais, podendo, desta forma, prejudicar a germinação das sementes. Considerando esse resultado e aqueles obtidos na técnica de confrontação direta, onde to­dos os isolados de trichoderma, em especial o 2B22 e o produto Agrotrich®, foram eficientes no antago­nismo aos quatro fungos testados, o estudo presen­te deixa possibilidades para a realização de outras pesquisas envolvendo a interação entre trichoderma e G. polymorpha, além de outras espécies florestais.

Conclusões

Os resultados obtidos no estudo efetuado permitem concluir que:

• O isolado 2B22 de T. harzianum e o produto comer­cial Agrotrich® são os mais eficientes no teste de pareamento de cultura no antagonismo a Bipolaris sp., Alternaria sp., Cladosporium sp. e Phoma sp.

• Os isolados TSM1 e TSM2 de T. viride, com exce­ção de Bipolaris sp., também são eficientes no an­tagonismo aos referidos fungos. Já o isolado 2B2 de T. harzianum apresenta eficiência somente no antagonismo a Alternaria sp. e Cladosporium sp.

• Todos os isolados de trichoderma e os dois pro­dutos comerciais testados são eficientes no con­trolo da contaminação fúngica dos diásporos de Gochnatia polymorpha pela técnica in vitro modifi­cada do papel celofane.

Agradecimentos

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Recebido/Received: 2012.08.20