Caracterização de endófitos da videira pertencentes ao complexo Epicoccum nigrum e sua interação com fungos do lenho da videira

Characterization of endophytes of grapevine belonging to Epicoccum nigrum complex and its interaction with grapevine trunk fungi

Tatiana Santos Coletto, Teresa Nascimento, Ana Cabral e Helena Oliveira^*

LEAF-Linking Landscape, Environment, Agriculture and Food, Instituto Superior de Agronomia, Universidade de Lisboa, Lisboa, Portugal

(*E-mail: heloliveira@isa.ulisboa.pt)

RESUMO

Endófitos do género Epicoccum são frequentemente isolados do lenho da videira, associados ou não a fungos patogénicos, designadamente a Fomitiporia mediterranea, Phaeomoniella (Pa.) chlamydospora, Phaeoacremonium (Pm.) minimum (sin. Pm. aleophilum), bem como a fungos “Botryosphaeriaceae”, mas desconhece-se o seu efeito em relação aos fungos que coabitam com esses endófitos. O presente estudo teve como objetivo avaliar a variabilidade de uma coleção de endófitos, do género Epicoccum (Epic), obtida a partir do lenho da videira e contribuir para a melhor compreensão das interações que estabelecem in vitro com fungos patogénicos do lenho da videira. Com base em características culturais e na sequenciação de parte do gene da β-tubulina (TUB2), os isolados foram agrupados em quatro grupos dentro do complexo E. nigrum, que revelou ser um complexo de espécies crípticas. Para avaliação das interações Epic versus fungos do lenho da videira, a coleção foi previamente testada contra um fungo “Botryosphaeriaceae”, tendo o isolado Epic 2 surgido no grupo dos que revelaram atividade antagonista significativamente mais elevada (α= 0,05). Epic 2 inibiu também significativamente o crescimento micelial dos fungos do complexo da esca, Pa. chlamydospora (45,8%), F. mediterranea (42,7%) e Pm. minimum (18,8%). Discutem-se os mecanismos de interação entre endófitos e fungos patogénicos do lenho da videira, bem como o potencial apresentado por Epic 2 como antagonista.

Palavras-chave: antagonismo, controlo biológico, fungos do lenho da videira, Vitis vinifera.

ABSTRACT

Keywords: antagonism, biological control, grapevine trunk fungi, Vitis vinifera.

INTRODUÇÃO

Todas as plantas no seu habitat natural encontram-se geralmente associadas a microrganismos endófitos, essencialmente bactérias e fungos (Pancher et al., 2012), os quais são considerados omnipresentes no reino Plantae. Atualmente, o termo endófito é utilizado para descrever microrganismos que podem também colonizar raízes e rebentos, causando infeções assintomáticas e que durante o seu ciclo de vida podem deixar de vir a exercer o papel de endófito (Porras-Alfaro e Bayman, 2011) e passar a atuar como agentes patogénicos durante o processo de senescência do hospedeiro (Aly et al., 2011). Os endófitos terão coevoluído com as plantas (Kusari et al., 2012), estabelecendo diferentes tipos de interações com o hospedeiro, desde mutualismo, comensalismo, a patogenicidade latente, saprofitismo latente e estados iniciais de colonização (Shulz e Boyle, 2006; Porras-Alfaro e Bayman, 2011). Essas interações apresentam uma elevada plasticidade fenotípica, em função do genótipo, estádio de desenvolvimento e estado nutricional do hospedeiro e de fatores ambientais (Shulz e Boyle, 2006).

Todas as espécies de plantas possuem uma comunidade endofítica que difere entre si, podendo haver espécies/isolados dominantes para o mesmo hospedeiro. Por sua vez, a composição da comunidade endofítica pode diferir significativamente para cada tipo de célula, tecido ou órgão da planta (Arnold, 2005; Schulz e Boyle, 2006; Aly et al., 2011; Porras-Alfaro e Bayman, 2011).

A entrada dos endófitos nos tecidos vegetais dá-se principalmente através de feridas e raízes secundárias laterais emergentes, podendo também penetrar via estomas, lentículas e hidátodos. Contudo, os fungos endófitos são capazes de produzir enzimas necessárias para penetrar e colonizar as plantas hospedeiras (Chandra, 2012; Rajesh e Rai, 2013), permitindo que estes vivam simbioticamente com a planta, e induzam mecanismos de defesa da planta hospedeira contra agentes patogénicos (Rajesh e Rai, 2013).

Uma vez no interior do hospedeiro, os endófitos entram em estado de latência e assim podem permanecer por um longo período ou por quase todo o tempo de vida do hospedeiro, dependendo das condições ambientais existentes (Aly et al., 2011). O equilíbrio planta-endófito pode ser alterado por fatores bióticos e abióticos, que ativam fatores de virulência dos fungos levando à patogenicidade, caso a defesa da planta diminua ou a virulência do fungo aumente (Schulz e Boyle 2006; Chandra, 2012; Kusari et al., 2012). Alguns endófitos não patogénicos terão tido origem a partir de agentes patogénicos, bem como agentes patogénicos poderão ter evoluído a partir de endófitos (Porras-Alfaro e Bayman, 2011).

A videira alberga no seu interior uma grande diversidade de fungos endófitos (Casieri et al., 2009; Pancher et al., 2012). Estes podem desempenhar um papel importante no equilíbrio da comunidade fúngica na videira, como patogénios latentes ou endófitos de proteção, sendo que alguns podem ser usados como agentes de controlo biológico (BCA).

Epicoccum nigrum Link é uma espécie omnipresente, distribuída em vários países dos continentes europeu, asiático e americano. Este fungo coloniza diferentes tipos de solos e inúmeras espécies de plantas com valor agronómico e medicinal (Amrani et al., 2014), apresentando vida saprofítica, patogénica ou endofítica. É isolado frequentemente a partir da videira, isoladamente ou em combinação com fungos patogénicos, designadamente com agentes causais das doenças do lenho da videira, Fomitiporia mediterranea, Phaeomoniella (Pa.) chlamydospora, Phaeoacremonium (Pm.) minimum, espécies de Botryosphaeriaceae, entre outros (Halleen et al., 2003; Bruez et al., 2014; Carlucci et al., 2015), não se sabendo exatamente o papel que E. nigrum desempenha na videira (Kuntzmann et al., 2010). Ainda assim, E. nigrum é conhecido por sintetizar vários compostos antimicrobianos, tais como epicorazinas A-B, epicoccinas A-D, epicoccarinas A-B, epirodinas A-B, flavipina, epipiridonas (Larena et al., 2005; Fávaro et al., 2012; Amrani et al., 2014), e demonstrar atividade antagonista em relação a diversos fungos e oomicetas fitopatogénicos, noutros hospedeiros, nomeadamente em relação a Ceratocystis paradoxa, Colletotrichum falcatum, Fusarium verticillioides, Monilinia laxa, Phythophthora sp. e Sclerotinia sclerotiorum (Larena et al., 2005; Fávaro et al., 2012).

Também os fungos mais frequentemente envolvidos na síndrome vascular do complexo da “esca” da videira, na Europa Pm. minimum e Pa. chlamydospora, podem viver assintomaticamente parte do seu ciclo de vida na planta mas, em algum momento, modificam o seu comportamento e tornam-se patogénicos (Mugnai et al., 1999; Graniti et al., 2000; Edwards e Pascoe, 2004; Slippers e Wingfield, 2007; Casieri et al., 2009; Hofstetter et al., 2012; Block et al., 2013; Ammad et al., 2014). No entanto, pouco se conhece sobre os mecanismos que desencadeiam a transição do modo de vida endofítico para o patogénico. Para Hofstetter et al. (2012), os fungos associados à “esca” não serão agentes patogénicos verdadeiros, mas provavelmente endófitos verdadeiros ou saprófitas latentes, ou saprófitas não-específicos que fazem parte de uma comunidade especializada na decomposição de madeira senescente ou matéria lenhosa morta.

MATERIAL E MÉTODOS

Caracterização de endófitos da videira do género Epicoccum

Estudaram-se 16 isolados do género Epicoccum, obtidos a partir do lenho da videira, cujos dados de passaporte se encontram descritos no Quadro 1.

Os isolados mantidos em micoteca, no Laboratório de Patologia Vegetal (DCEB/ISA), em tubos contendo PDA (Gelose de Batata Dextrosada, BD-Difco), à temperatura de 4 ºC, na obscuridade, foram transferidos para placas de Petri de poliestireno (90 mm de diâmetro) contendo gelose de batata dextrosada (PDA – BD-Difco, E.U.A) e incubados a 25 ºC na obscuridade, durante 10 dias. Findo esse período, e porque a maioria das culturas não esporulou, procedeu-se à purificação das culturas pelo método de hifa única, com recurso a uma lupa binocular, para meio de PDA.

As características culturais dos isolados de Epicoccum (aspeto cultural, densidade, frente de crescimento, transparência, zonagem, pigmentos) foram avaliadas nos seguintes meios de cultura sólidos: PDA, gelose de extrato de malte (Malt Extract Agar – MEA, BD-Difco, Detroit, E.U.A.), gelose de Czapeck-Dox (BD-Difco, E.U.A). e gelose de aveia (Oatmeal Agar – OA, BD-Difco, E.U.A.), após um período de incubação a 28 ºC, na obscuridade, durante 20 dias (Fávaro et al., 2011). A coloração das colónias (frente e verso) foi determinada por comparação com as constantes da carta de cores de Rayner (1970). O crescimento micelial de cada um dos isolados foi avaliado ao fim de 12 dias de incubação, antes das culturas atingirem o bordo das placas. Para o efeito, foi efetuada a medição do diâmetro de cada uma das colónias, segundo dois eixos ortogonais, e calculada a média aritmética dos valores obtidos para cada isolado e repetição (três por isolado). Os resultados do crescimento micelial foram analisados estatisticamente, através da Análise de Variância (ANOVA) a um fator (isolado) e as médias comparadas com recurso ao teste de Tukey (α= 0,05) no programa Statistica 7.0 (StatSoft).

Para a identificação molecular dos isolados em estudo, incluíram-se três isolados de referência pertencentes à coleção do CBS-KNAW, Westerdijk Fungal Biodiversity Institute, Holanda: CBS 173.38, Epicoccum nigrum, ex-type strain of Epicoccum mezzetti Goid.; CBS 173.73, Epicoccum nigrum, ex-type strain of Phoma epicoccina Punith., M.C. Tulloch & C.M. Leach e CBS 246.60, Epicoccum pimprinum, ex-type of Phoma pimprina P. N. Mathur, S. K. Menon & Thirum.

O DNA fúngico foi extraído utilizando o protocolo descrito por Cenis (1992), com adaptações de Nascimento et al. (2001). A análise do DNA foi determinada com base na sequenciação de parte do gene da β-tubulina (TUB2). Foram utilizados os “primers” T1 e T2 de O’Donnell e Cigelnik (1997). As reações de PCR foram preparadas com um volume final de 30 μL, utilizando 32 μM de cada dNTP, 0,16 μM de cada “primer”, 1,0 U de Taq DNA polimerase (Dream Taq, Thermo Fisher Scientific, Lituânia) e 3 μL de DNA previamente diluído à concentração de 10 ng/μL. A reação PCR decorreu num termociclador S1000 (Bio-Rad, E.U.A.) com o seguinte programa: pré-desnaturação a 94 ºC, durante 5 min, seguida de 40 ciclos de 30 s a 94 ºC (desnaturação), 30 s a 58 ºC (emparelhamento), 1 min. e 30 s a 72 ºC (extensão), terminando com um período de extensão final de 10 min a 72 ºC. Os produtos de PCR foram confirmados por eletroforese em gel de agarose (Invitrogen, E.U.A.) e sequenciados pela StabVida (Portugal). As sequências foram assembladas e editadas para resolver ambiguidades utilizando o módulo SeqMan 5.05 do programa DNASTAR (Lasergene, E.U.A.). As sequências dos isolados em estudo, juntamente com outras sequências TUB2 de Epicoccum spp. obtidas do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), foram alinhadas utilizando o MUSCLE no programa MEGA 6.06 (Tamura et al., 2013) e o alinhamento final foi posteriormente ajustado manualmente.

A análise filogenética foi implementada no MEGA 6.06, utilizando a máxima parcimónia com o algoritmo “subtree-pruning-regrafting”, os “gaps” e os dados em falta foram tratados como “complete deletions”. A robustez da topologia foi avaliada por 1000 replicações de bootstrap (Felsenstein, 1985). Foram também calculadas as medidas da máxima parcimónia tais como o comprimento da árvore (TL), o índice de consistência (CI), o índice de retenção (RI) e o índice de consistência reescalonado (RC). A espécie Epicoccum sorghinum (CBS 179.80 e CBS 627.68) foi utilizada para “enraizar” a árvore obtida.

Interação entre Epicoccum nigrum e fungos do lenho da videira

Nos estudos de interação pelo método de cultura pareada, testaram-se os 16 isolados do género Epicoccum, em relação a um isolado de “Botryosphaeria” sp. (Quadro 1). Retiraram-se discos miceliais (4 mm de diâmetro) de cada um dos fungos a confrontar, que se transferiram para placas de Petri contendo 15 mL de PDA, posicionando-os em locais opostos, afastados entre si cerca de 40 mm e 25 mm do bordo da placa (culturas pareadas). As placas foram incubadas a 25 ºC sob obscuridade durante três dias, e para cada combinação “Botryosphaeria” sp. x Epicoccum spp. foram realizadas duas repetições. O crescimento micelial foi avaliado pela medição de dois raios de cada uma das colónias, um em direção à extremidade da placa (r1) e outro em direção ao fungo em confronto (r2). A inibição do crescimento micelial, expressa em percentagem, foi calculada através da fórmula de Fokkema: I (%)=(r1-r2)/r1 x 100 (Fokkema, 1973). Os resultados foram analisados estatisticamente (programa Statistica 7.0, StatSoft), através da ANOVA a um fator para um nível de significância de 0,05, uma vez que não se observaram violações ao pressuposto do modelo linear (dados não mostrados). A comparação das médias do crescimento micelial foi realizada com recurso ao teste de Tukey (α=0,05).

No estudo da interação Epicoccum x fungos do complexo da esca (Pa. chlamydospora, Pm. minimum e F. mediterranea), selecionou-se apenas um dos isolados do género Epicoccum (Epic 2), que se enquadrou no grupo que proporcionou maior poder de inibição sobre “Botryosphaeria” sp.

A preparação das culturas pareadas Epicoccum x fungo do complexo da esca, o método de inoculação e as condições de incubação foram em tudo iguais às descritas para a interação Epicoccum spp. x Botryosphaeria sp.; exceto a duração do período de incubação, que se prolongou por 14 dias. Realizaram-se cinco repetições de cada uma das combinações (Epic 2 x fungo do complexo da esca) e os resultados foram avaliados e analisados estatisticamente aos 7 e 14 dias de crescimento, tal como descrito anteriormente.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Caracterização de endófitos da videira do género Epicoccum

A análise das características culturais da coleção de fungos do género Epicoccum indica a impossibilidade de agrupar as diferentes culturas em morfotipos, com exceção para os isolados Epic 7 e Epic 8, que apresentaram as mesmas características culturais nos meios PDA e Czapeck-Dox, podendo dessa forma ser inseridos num mesmo grupo.

Em PDA, com exceção de Epic 3, Epic 5, Epic 13, Epic 15-16, os demais isolados revelaram aspeto cultural compatível com a espécie Epicoccum nigrum, usualmente caracterizada por coloração próxima do “orange” (frente da colónia) e variando o reverso de “orange” a “dark red”, além da frente de crescimento irregular e da presença de pigmento difundível no meio de cultura (Bonnell e Levetin, 1981; Fávaro et al., 2011) (Figura 1). Ainda assim, a ausência de esporulação nas culturas estudadas dificultou a identificação da espécie, com base nas características morfológicas. A variabilidade de E. nigrum no que respeita à capacidade de esporulação é conhecida, e está dependente dos nutrientes disponíveis no meio de cultura (Bonnell e Levetin, 1981), do fotoperíodo e de características intrínsecas ao isolado, havendo alguns que são absolutamente dependentes de um período de exposição à luz para iniciarem a esporulação, em particular em meio PDA (Bonnell e Levetin, 1982). Estes aspetos deverão ser tomados em consideração em trabalhos futuros.

Em meio Czapeck-Dox, a coloração dos isolados foi muito variável, entre ”buff”, ”isabelline”, “orange”, “sepia”, ”olivaceous” a “brick”; a frente de crescimento apresentou-se maioritariamente irregular, com exceção para Epic 3, Epic 6-8, Epic 15-16, e não foi observada zonagem nas culturas. Pela variabilidade observada, este meio não permitiu agrupar isolados, ao contrário do referido por Fávaro et al. (2011) para o meio Czapeck-Dox (Figura 1). Ainda assim, a composição dos dois meios de cultura não é exatamente coincidente.

Todos os isolados apresentaram em meio OA uma densidade da colónia maioritariamente forte, ou média/forte, com exceção do isolado Epic 14; a frente de crescimento foi maioritariamente regular, zonagem ausente, exceto em Epic 6 e Epic 9 e a coloração das culturas foi muito variável (Figura 1). Pela variabilidade observada, o meio OA também não se revelou muito adequado para identificar grupos na espécie ou complexo E. nigrum.

Para efeitos da caracterização da coleção em estudo, com base no crescimento micelial dos 16 isolados do género Epicoccum em diferentes meios de cultura (PDA, MEA, Czapeck-Dox e OA) e à temperatura de 28 °C, a ANOVA dos resultados revelou diferenças significativas entre isolados (P≤0,05), para cada um dos meios de cultura. A comparação das médias do crescimento micelial evidenciou um grupo de isolados com menor crescimento, a diferir significativamente de outro grupo com maior crescimento (Figura 2).

Em meio de PDA, o diâmetro das colónias de Epicoccum variou entre 18 e 73 mm. O meio de PDA foi um dos que permitiu melhor agrupamento dos isolados, com Epic 13 a apresentar maior crescimento micelial, ainda assim a não diferir significativamente de Epic 3 e Epic 5. No meio MEA, o diâmetro das colónias variou entre 25 e 77 mm. O isolado Epic 3 foi o que apresentou maior crescimento micelial, não diferindo significativamente de Epic 13 e Epic 16. Em OA o crescimento micelial variou entre 39 e 77 mm, sendo que Epic 3-4 e Epic 9 demonstraram as médias de crescimento mais elevadas, ainda assim não diferindo significativamente das apresentadas pelos isolados Epic 2, Epic 5 e Epic 11. No meio Czapeck-Dox, o crescimento dos isolados variou entre 15 e 80 mm, com os isolados Epic 2-3, Epic 5, Epic 9, Epic 11, Epic 13 e Epic 16 a apresentarem as médias mais elevadas, não diferindo significativamente entre si, nem de Epic 4.

Em resumo, no meio de PDA destacaram-se sete isolados com crescimento reduzido (Epic 1, 6-8, 10, 12 e 15). Em meio de MEA surgiram seis isolados com idêntico comportamento (Epic 1, 6, 7, 10, 14 e 15) e em meio de OA destacaram-se novamente sete isolados com crescimento reduzido (Epic 1, 6, 7, 10, 12, 14 e 15), que coincide com o grupo anterior mais o isolado Epic 12, também discriminado em PDA. No que se refere ao meio Czapeck-Dox, destacaram-se sobretudo os isolados com maior crescimento micelial (Epic 2, 3, 5, 9, 11, 13 e 16), a não diferirem significativamente de Epic 4.

A espécie E. nigrum é conhecida por apresentar elevada variabilidade morfológica e cultural (Schol-Schwarz, 1959; Kilpatrick e Chilvers, 1981; Arenal et al., 2002). Tais características podem variar com fatores ambientais e condições de cultura, como a temperatura e a composição do meio em nutrientes (Bonnell e Levetin, 1981). No entanto, estas diferentes características dos isolados têm sido confundidas com variação intraespecífica (Fávaro et al., 2011), o que pode ter levado a erros na identificação de isolados da espécie E. nigrum, caso esta englobe diferentes espécies crípticas.

Os resultados obtidos no presente estudo corroboram essa variabilidade, nomeadamente entre os isolados de Epicoccum (E. nigrum) provenientes de um mesmo hospedeiro (V. vinifera) e de uma mesma região geográfica (Tavira, Portugal), como é o caso dos isolados Epic 4 a 16. Ainda assim, para inferir se essa variabilidade é de natureza intraespecífica, equivalendo à presença de diferentes genótipos na mesma espécie, ou se é de natureza interespecífica, correspondendo a diferentes espécies em E. nigrum, é essencial o uso de uma abordagem polifásica, com recurso a diferentes marcadores, desde morfoculturais, fisiológicos aos moleculares (Fávaro et al., 2011).

A caracterização molecular dos isolados de Epicoccum spp. foi levada a efeito usando sequências de parte do gene da β-tubulina (TUB2), por se ter revelado em trabalhos anteriores tão discriminante quanto a região ITS1-5.8S-ITS2 (Fávaro et al., 2011). A análise filogenética das sequências TUB2 dos isolados de Epicoccum em estudo, juntamente com sequências do mesmo gene de Epicoccum spp. obtidas do GenBank, permitiu agrupar os isolados em quatro grupos dentro do complexo E. nigrum, o que sugere estarmos perante um complexo de espécies (Figura 3).

O isolado Epic 1 agrupa com o isolado de referência CBS 173.38, que é o isolado-tipo de E. mezzettii, atualmente considerado sinónimo de E. nigrum. Os isolados Epic 6-9 encontram-se numa posição basal ao grupo que contém o isolado de referência CBS 173.73 para Phoma epicoccina, atualmente designado E. nigrum. Os isolados Epic 2-4, Epic 10-14 e Epic 16 encontram-se agrupados no mesmo grupo com um valor de bootstrap de 78%, sendo que o isolado Epic 10 é distinto dos restantes desse grupo. O isolado Epic 15 é filogeneticamente próximo dos isolados CE 7; CE 12, CE 24 e CE27 obtidos do GenBank. O grupo formado por estes isolados apresenta um valor de bootstrap de apenas 30%. Nenhum dos isolados em estudo agrupou com as espécies Epicoccum pimprinum (sin. Phoma pimprina) ou Epicoccum sorghi (sin. Phyllosticta sorghina), as quais, em conjunto com E. nigrum, formam o grupo M-Epicoccum na família Didymellaceae (Aveskamp et al., 2010). A análise de parcimónia de 286 carateres resultou em duas árvores mais parcimoniosas (TL = 55 passos; CI = 0,673469; RI = 0,926606; e RC= 0,657048), a primeira das quais é apresentada na Figura 3.

A caracterização molecular da coleção de E. nigrum obtida de videira, ainda que baseada apenas na sequenciação do gene TUB2, aponta como hipótese mais plausível que E. nigrum seja um complexo de espécies, conforme explicado anteriormente. Também o estudo realizado por Fávaro et al. (2011), com isolados de cana-de-açúcar, revelou a presença inequívoca de dois grupos de isolados que, apesar de identificados como E. nigrum no GenBank, corresponderão a duas espécies distintas, a necessitar de resolução/identificação. Para que esta possa ser levada a efeito, serão necessários estudos mais aprofundados, com recurso a uma análise multigénica.

A correta identificação de espécies no complexo E. nigrum é muito importante, não por simples curiosidade sistemática mas porque, englobando distintos isolados com potencial para controlo biológico contra diversas doenças e em diversas culturas (Elmer et al., 2001; Elmer e Reglinski, 2006), é essencial conhecer-se que linhagem, espécie ou espécies apresentam esse potencial (Fávaro et al., 2011).

Interação entre Epicoccum nigrum e fungos do lenho da videira

Os fungos Botryosphaeriaceae são importantes agentes patogénicos da videira e, comparativamente a outros fungos do lenho, têm crescimento micelial muito rápido. Em regra, sobrepõem-se aos restantes fungos do lenho da videira. Neste trabalho admitiu-se que, idealmente, o isolado do género Epicoccum a selecionar, contra os fungos envolvidos no complexo da esca, deveria ter igualmente algum poder de inibição sobre fungos Botryosphaeriaceae. Para o efeito, antes de selecionar o isolado de Epicoccum a testar contra os restantes fungos do lenho, testou-se toda a coleção relativamente a um isolado de “Botryosphaeria” sp.

Os resultados apurados permitiram confirmar a existência de diferenças significativas entre isolados de Epicoccum, relativamente a “Botryosphaeria” sp. (P≤0,05), com evidência de um efeito inibidor mais acentuado, ainda que modesto, para os isolados Epic 2, Epic 3 e Epic 13, que não diferiram significativamente entre si, nem da maioria dos restantes isolados (Figura 4).

É de notar que sobretudo Epic 6 revelou tendência para favorecer o crescimento micelial de “Botryosphaeria” sp. O crescimento muito rápido deste fungo, associado ao facto de formar abundante micélio aéreo, dificultou as leituras deste ensaio, aumentando a probabilidade de erro, pelo que as variâncias associadas às médias foram elevadas. Assim se explica que os isolados de Epicoccum com comportamento intermédio não tenham diferido significativamente nem dos melhores nem dos piores.

Os resultados do estudo de interação Epicoccum (isolado Epic 2) versus os principais fungos envolvidos no complexo da esca da videira, Pa. chlamydospora, Pm. minimum e F. mediterranea, foram registados ao fim de 7 e 14 dias de incubação. Inicialmente (7 dias), Epicoccum inibiu significativamente o crescimento micelial de F. mediterranea (Figura 5), mas essa inibição não foi significativamente diferente da produzida sobre Pa. chlamydospora que, por sua vez, não diferiu da observada relativamente a Pm. minimum. Posteriormente (14 dias), os efeitos foram mais evidentes, sendo todos os fungos inibidos por Epicoccum, ainda assim, com um efeito menos significativo sobre Pm. minimum (Figura 5).

A inibição de Pa. chlamydospora por Epic 2 pode ser devida à produção de metabolitos secundários produzidos por Epic 2 (antibiose), sendo este um dos mecanismos de antagonismo descritos em interações fúngicas envolvendo Epicoccum, ou seja, o antagonista não é afetado, mas origina redução de crescimento (ou morte) da espécie antagonizada. Os efeitos de Epicoccum sobre Pa. chlamydospora parecem mesmo ter afetado a cultura para além da zona de proximidade Epicoccum/Pa. chlamydospora (r1), uma vez que se observou um halo de inibição em torno deste último fungo. Para confirmar esta hipótese, foi realizada uma ANOVA, comparando o crescimento de Pa. chlamydospora, ao fim de 14 dias de incubação, quando confrontado com ele mesmo (controlo) e com Epicoccum, o que permitiu verificar que o valor médio de r1, ainda que ligeiramente, diferiu significativamente numa e noutra condição de ensaio (F=7,2; P= 0,02778), o que comprova que o efeito de inibição se estendeu a toda a colónia (Figura 6).

A inibição de F. mediterranea por Epicoccum aparenta tratar-se, sobretudo, de um mecanismo de competição pelo espaço e nutrientes, onde Epic 2 parece travar o crescimento de F. mediterranea (Figura 6). Ainda assim, a margem da colónia de cada um dos fungos não se confronta em toda a sua extensão, havendo a possibilidade de Epicoccum estar a exercer alguma ação de antagonismo sobre o fungo patogénico. De salientar que não se verificaram diferenças significativas de crescimento entre os valores de r1 de Fomitiporia x Fomitiporia (controlo) e os de Fomitiporia x Epicoccum (F=0,167; P=0,6938).

Os efeitos de Epic 2 sobre Pm. minimum são mais complexos. Aparentemente, no início do ensaio (7 dias) o antagonista pareceu favorecer o crescimento de Pm. minimum, o que não foi comprovado estatisticamente, pois esse ligeiro favorecimento não diferiu significativamente da inibição produzida sobre Pa. chlamydospora, ao fim de igual período de incubação, tal como foi evidenciado na Figura 5. A circunstância de ambos os fungos patogénicos terem crescimento muito lento explica a dificuldade na determinação do crescimento exato de cada um dos fungos, para um período de incubação tão curto. Decorridos 14 dias de incubação, verificou-se que Epic 2 inibia efetivamente Pm. minimum, tanto mais que o valor de r1, nestas condições, não diferiu significativamente do valor de r1, quando Pm. minimum foi confrontado com ele próprio (F=1,00; P=0,3466). Por conseguinte, a inibição de Pm. minimum, parece ter resultado de uma conjugação de mecanismos de competição e antibiose (Figura 6).

Inúmeros compostos produzidos por E. nigrum encontram-se descritos na literatura como possuindo ação antimicrobiana. Dentre os melhor caracterizados, salientam-se a flavipina e as epicorazina A e B, que têm revelado efeitos positivos no controlo biológico de Monilinia spp. e de diversos oomicetas, designadamente pertencentes aos géneros Pythium e Phytophthora. Por sua vez, a flavipina, para além da ação anti-fúngica, tem demonstrado igualmente ação antagonista contra inúmeras bactérias fitopatogénicas (Madrigal et al., 1991; Fávaro et al., 2012), revelando um amplo espetro de ação e o potencial interesse para o controlo biológico de uma vasta gama de organismos fitopatogénicos.

Em videira, é conhecida a ação antagonista de fungos do género Epicoccum em relação a Plasmopara viticola (Kortekamp, 1997) e a B. cinerea (Elmer e Reglinski, 2006). Também se sabe que fungos do género Epicoccum são frequentemente isolados do lenho da videira, admitindo-se que possam atuar como agentes de controlo biológico (Pancher et al., 2012; Bruez et al., 2014). Ainda assim, desconhece-se com exatidão o mecanismo de ação e o seu papel na comunidade fúngica que com eles habitam.

Também se encontra relatado o possível efeito de E. nigrum (a par de Aureobasidium pullulans) na recuperação natural de castas de videira afetadas pelo fitoplasma causador da Flavescência Dourada (Martini et al., 2009).

Relativamente aos fungos do lenho da videira, apesar de espécies do género Epicoccum (maioritariamente referidas como E. nigrum) serem frequentemente isoladas quer de videiras doentes quer de videiras sãs (Pancher et al., 2012; Bruez et al., 2014), não existem estudos sobre as relações que se estabelecem entre estes endófitos e os agentes causais das doenças do lenho. No decurso do presente estudo foi igualmente isolado Epicoccum do lenho da videira, sendo Epic 2 um exemplo de isolado obtido de varas de videira aparentemente sãs.

A crescente restrição legal à utilização da luta química no controlo dos inimigos das culturas, por motivos de toxicidade para o homem, animais e para o ambiente, justifica que se desenvolvam alternativas viáveis aos produtos químicos de síntese, baseadas em práticas culturais adequadas, mas também recorrendo a organismos de controlo biológico ou a produtos resultantes do seu metabolismo secundário. Face aos resultados apurados no presente estudo, os fungos do género Epicoccum surgem como promissores agentes de controlo biológico e a merecer estudos mais aprofundados, designadamente a validação in planta.

CONCLUSÕES

Os isolados estudados, pertencentes ao género Epicoccum, revelaram elevada variabilidade fenotípica e molecular, indicando que, muito provavelmente, E. nigrum encerra um complexo de espécies.

Alguns dos isolados de Epicoccum (16 isolados), em particular Epic 2, 3 e 13 foram capazes de inibir o crescimento micelial de um fungo Botryosphaeriaceae, associado ao dieback da videira. O isolado selecionado no prosseguimento dos estudos (Epic 2) inibiu significativamente o crescimento micelial de Pa. chlamydospora, F. mediterranea e, em menor extensão o de Pm. minimum, principais fungos envolvidos no complexo da “esca” da videira.

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Recebido/received: 2018.01.20

Aceite/accepted: 2018.12.23