Interações entre fungos do pé negro da videira e do complexo da esca

Interactions between fungi associated with black-foot disease and esca disease complex of grapevine

Tatiana Santos Coletto, Teresa Nascimento e Helena Oliveira^*

LEAF-Linking Landscape, Environment, Agriculture and Food, Instituto Superior de Agronomia, Universidade de Lisboa, Lisboa, Portugal

(*E-mail: heloliveira@isa.ulisboa.pt)

RESUMO

Muitos dos fungos envolvidos na doença do pé negro e no complexo da esca ocorrem numa mesma videira, mas as interações que se estabelecem entre eles são pouco conhecidas. Em materiais de propagação vegetativa e videiras jovens coexistem frequentemente agentes causadores da doença de Petri (Phaeoacremonium (Pm.) minimum e/ou Phaeomoniella (Pa.) chlamydospora) e do pé negro (entre outros, Ilyonectria liriodendri e Dactylonectria macrodidyma). Em videiras adultas, a estes fungos associam-se por vezes basidiomicetas, nomeadamente Fomitiporia mediterranea, responsável pelo sintoma de podridão-branca do lenho, característico da “esca”. O presente estudo teve como objetivo clarificar como interagem in vitro fungos responsáveis pela doença de Petri e pelo pé negro da videira, no seu conjunto responsáveis pelo declínio de videiras jovens. Complementarmente avaliaram-se ainda interações entre os principais fungos envolvidos no “complexo da esca”, Pm. minimum (= Pm. aleophilum), Pa. chlamydospora e F. mediterranea. Os resultados obtidos indicam que o crescimento micelial de I. liriodendri e D. macrodidyma é significativamente favorecido pela presença de Pa. chlamydospora ou Pm. minimum. Por sua vez, o fungo F. mediterranea, inicialmente favorecido por Pa. chlamydospora e Pm. minimum, é posteriormente inibido por Pm. minimum, mas não por Pa. chlamydospora.

Palavras-chave: Dactylonectria macrodidyma, Fomitiporia mediterranea, Ilyonectria liriodendri, Phaeoacremonium minimum, Phaeomoniella chlamydospora.

ABSTRACT

Keywords: Dactylonectria macrodidyma, Fomitiporia mediterranea, Ilyonectria liriodendri, Phaeoacremonium minimum, Phaeomoniella chlamydospora.

INTRODUÇÃO

As doenças do lenho da videira (grapevine trunk diseases) são causadas por fungos patogénicos que deterioram os órgãos perenes da videira (Vitis vinifera L. e Vitis spp.) (Magnin-Robert et al., 2014). Dentre estas doenças destacam-se, pela sua importância mundial, a esca, a doença de Petri, a botriosferiose e a eutipiose (Mugnai et al., 1999; Bertsch et al., 2012; Hofstetter et al., 2012), bem como o pé negro da videira (Rego, 2004; Gubler et al., 2005; Cabral, 2011; Gramaje e Armengol, 2011). Muitos dos agentes causais destas doenças estão presentes em plantas-mãe de porta-enxertos e de garfos, plantas provenientes de viveiro vitícola, videiras jovens e videiras adultas (Gramaje e Armengol, 2011; Agustí-Brisach et al., 2013; Gramaje, 2016).

Uma videira portadora de doença do lenho abriga no seu interior um complexo de fungos patogénicos que podem atuar simultaneamente ou de forma sequencial, podendo haver um agente patogénico dominante (Rego et al., 2012). As interações patogénio-patogénio e patogénio-ambiente na videira são bastante complexas e dependem das espécies de fungos que colonizam os tecidos do lenho, das caraterísticas do hospedeiro, bem como das condições ambientais a que estes estão sujeitos.

O pé negro da videira, associado a fungos dos géneros “Cylindrocarpon”/Ilyonectria, Campylocarpon, Cylindrocladiella e Dactylonectria, afeta sobretudo materiais de propagação vegetativa de videira, viveiros vitícolas e videiras jovens, originando, em casos severos, o declínio e morte das plantas (Scheck et al.,1998; Halleen et al., 2004; Rego, 2004; Cabral, 2011; Cabral et al., 2012a, b; Agustí-Brisach e Armengol, 2013). Os sintomas característicos desta doença incluem lesões necróticas nas raízes e redução da biomassa radicular, bem como necroses internas no lenho, com maior incidência na base do porta-enxerto. Em consequência, as plantas apresentam atraso no desenvolvimento, crescimento raquítico, vigor reduzido, entrenós curtos e clorose ou necrose foliar (Rego et al., 2000; Halleen et al., 2006; Agustí-Brisach e Armengol, 2013).

Por sua vez, a doença de Petri da videira, uma das doenças incluídas no “complexo da esca”, é causada por Phaeoacremonium (Pm.) minimum, outras espécies de Phaeoacremonium e Phaeomoniella (Pa.) chlamydospora. Origina sintomas que se confundem com os do pé negro da videira (Rego et al., 2000; Agustí-Brisach e Armengol, 2013; Úrbez-Torres et al., 2014), mas, por vezes, em corte transversal, as plantas atacadas exibem exsudação de goma viscosa negra (“black goo”). Os respetivos agentes causais podem coexistir numa mesma planta (Rego et al., 2000) e podem ainda surgir em associação, entre outros, com fungos Botryosphaeriaceae e Phomopsis spp. formando complexos de doenças (Oliveira et al., 2004; Halleen et al., 2007). Ainda não estão esclarecidas as interações que estes fungos estabelecem entre si, salvo raras exceções para os fungos da “esca propriamente dita” ou “esca proper” (Sparapano et al., 2000c).

A “esca proper”, ou “esca” refere-se a um complexo de duas doenças que podem ocorrer em simultâneo na mesma videira: podridão branca ou “white-rot” e doença vascular (Surico, 2009; Andolfi et al., 2011), sendo a última causada pelos mesmos fungos que originam a doença de Petri. Já a podridão branca (“white-rot”) é causada por fungos basidiomicetas, dentre os quais se destaca Fomitiporia mediterranea pela sua importância na Europa (Fischer, 2006) e em Portugal. A “esca” é uma doença de caráter destrutivo, cuja incidência tem vindo a aumentar à escala mundial ao longo dos últimos anos, sendo particularmente grave em regiões vitivinícolas do Mediterrâneo, onde é conhecida desde há mais de 100 anos (Fischer e Kassemeyer, 2003).

Videiras afetadas por “esca”, estão frequentemente colonizadas por Pa. chlamydospora e Pm. minimum, considerados fungos primários ou precursores, que atacam o lenho da videira e que abrem caminho à atuação dos “fungos de degradação final da madeira”, os basidiomicetas, designadamente F. mediterranea. Outros fungos podem ser isolados de videiras afetadas por esca (Eutypa spp., outras espécies de Phaeoacremonium, fungos Botryosphaeriaceae, fungos do complexo “Cylindrocarpon”/Dactylonectria/Ilyonectria, bem como Phomopsis spp.), os quais podem estar associados à doença (ou não). Os mecanismos de interação existentes entre estes fungos encontram-se ainda mal esclarecidos (Graniti et al., 2000; Fisher e Kassemeyer, 2003; Bruez et al., 2016).

Estudos realizados em videira, indicam que Pm. minimum e Pa. chlamydospora compartilham o mesmo nicho ecológico, atuando sinergicamente, em que Pa. chlamydospora secretará toxinas que reduzem as defesas da planta, favorecendo a atividade de Pm. minimum (Luini et al., 2010; Magnin-Robert et al., 2014; Pierron et al., 2016). Dados genómicos recentes revelam que Pa. chlamydospora e Pm. minimum possuem baixa virulência, quando comparados com outros fungos patogénicos, sugerindo que eles possam interagir com outros fungos associados ao lenho da videira (Pierron et al., 2016).

Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar as interações entre os principais fungos responsáveis pela doença de Petri e pelo pé negro da videira, no seu conjunto responsáveis pelo declínio de videiras jovens, bem como as interações entre fungos envolvidos na “esca” da videira.

MATERIAL E MÉTODOS

Isolados e condições de cultura

Os fungos do lenho da videira usados no presente estudo encontravam-se conservados em micoteca, no Laboratório Patologia Vegetal (DCEB/ISA), em tubos contendo PDA (Gelose de Batata Dextrosada, BD-Difco), à temperatura de 4 ºC, na obscuridade. Estudaram-se no total cinco fungos: Dactylonectria macrodydima (CBS 112615), Ilyonectria liriodendri (Cy68=CBS 117526), Fomitiporia mediterranea, Phaeoacremonium (Pm.) minimum e Phaeomoniella (Pa.) chlamydospora (CBS 161.90). Os isolados com acrónimo CBS integram a coleção de fungos do CBS-KNAW, Westerdijk Fungal Biodiversity Institute, Utrecht, Holanda. Todos os ensaios foram realizados em placas de Petri de poliestireno com 90 mm de diâmetro, contendo 15 mL de PDA, e incubadas à temperatura de 25 ºC, na obscuridade. Para obtenção dos pré-inóculos, cada um dos fungos foi cultivado, nas condições descritas, durante períodos de incubação variáveis, consoante a taxa de crescimento de cada um.

Testes de interação pelo método de culturas pareadas

Retiraram-se discos miceliais (4 mm de diâmetro) de cada um dos isolados, a partir da margem das colónias crescidas como pré-inóculo, que se posicionaram em locais opostos de placas de Petri contendo 15 mL de meio PDA, afastados entre si cerca de 40 mm e 25 mm do bordo da placa (cultura pareada, Figura 1A). Nos casos em que se confrontou o crescimento de três fungos, os discos miceliais foram dispostos nos vértices de um triângulo com aproximadamente 40 mm de lado (Figura 1B). Após inoculação, as placas foram seladas com Parafilm e incubadas durante 11 dias para os fungos envolvidos no pé negro da videira, D. macrodidyma e I. liriodendri, e até 14 dias, para os fungos responsáveis pelo complexo da esca, F. mediterranea, Pa. chlamydospora e Pm. minimum (Sparapano et al., 2000c).

O crescimento micelial foi avaliado pela medição de dois raios de cada uma das colónias, um em direção à extremidade da placa (r1) e outro em direção ao fungo em confronto (r2). Para cada combinação fungo x fungo foram realizadas 4 repetições. A inibição do crescimento micelial, expressa em percentagem, foi determinada através da fórmula de Fokkema (1973), I (%)=(r1-r2)/r1 x 100.

Os parâmetros avaliados neste ensaio incluíram ainda observação da alteração da coloração das colónias dos isolados e desenvolvimento de linha de confronto vegetativo, entre culturas. Os tipos de interação existentes entre dois isolados foram classificados de acordo com Tuininga (2005) (Quadro 1).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados apurados indicam que os fungos causadores do pé negro da videira, D. macrodidyma (CBS 112615) e I. liriodendri (Cy68), são favorecidos no seu crescimento micelial pelos fungos Pa. chlamydospora e Pm. minimum, agentes causadores da doença de Petri (Figuras 1, 2 e 3).

Analisando as interações que se estabelecem em cultura pareada, verifica-se que o crescimento micelial de I. liriodendri é ligeiramente inibido quando este fungo é confrontado entre si (Figuras 1, A1-A2 e 2), sugerindo uma relação de coantagonismo (redução do crescimento de ambas as culturas), mas é favorecido quando pareado com D. macrodidyma. Por sua vez, Pa. chlamydospora e, sobretudo, Pm. minimum favorecem significativamente o crescimento de I. liriodendri. Já o crescimento de D. macrodidyma é ligeiramente inibido por I. liriodendri (Figuras 1, B1-B2 e 2), indicando um fenómeno de agonismo, em que a redução do crescimento de uma das espécies é acompanhada pelo aumento do crescimento da outra espécie, e no confronto com D. macrodidyma (Figura 1, E1-E2), evidenciando neste caso uma interação do tipo coantagonismo. O crescimento de D. macrodidyma é significativamente favorecido pela presença de qualquer um dos agentes causadores da doença de Petri, Pa. chlamydospora e Pm. minimum (Figura 2).

No confronto entre fungos da doença de Petri e do pé negro verifica-se que o crescimento de Pa. chlamydospora é significativamente inibido por I. liriodendri (Figuras 1, C1-C2 e 3), e ligeiramente inibido por D. macrodidyma (Figuras 1, F1- F2 e 3), evidenciado pelo agonismo, enquanto o de Pm. minimum é inibido quer pelo isolado de Ilyonectria quer pelo de Dactylonectria, sugerindo igualmente uma interação do tipo agonismo (Figuras 1, D1- D2, G1- G2 e 3).

Os resultados globais deste ensaio apontam no sentido do favorecimento acentuado e significativo do crescimento dos fungos responsáveis pelo pé negro da videira (Dactylonectria sp. e Ilyonectria sp.), quando presentes os agentes da doença de Petri.

As relações entre os fungos causadores da “esca” da videira são complexas e estão ainda mal esclarecidas. Quando o basidiomiceta F. mediterranea é confrontado entre si, em cultura pareada, verifica-se uma ligeira inibição do crescimento de uma das colónias (Figura 4, A1-A2 e 5), o mesmo não se verificando na segunda colónia.

Por sua vez, quando se analisa o crescimento micelial de F. mediterranea, face a outros fungos envolvidos na “esca”, verifica-se que Pm. minimum e Pa. chlamydospora estimulam o crescimento do basidiomiceta, com efeito mais significativo de Pa. chlamydospora, evidenciando um fenómeno de agonismo (Figura 5). Ainda assim, tal como se pode observar na Figura 4 (B1-B2), a margem da colónia de F. mediterranea é abruptamente interrompida na proximidade de Pm. minimum, formando-se uma barreira espessa de cor castanha que impede o posterior crescimento de F. mediterranea, indicando um fenómeno de antagonismo exercido por Pm. minimum, em relação a F. mediterranea.

Naquele confronto verifica-se a alteração da cor da colónia de Pm. minimum (face superior da colónia) e de F. mediterranea (face inferior da colónia), provavelmente devido à produção de pigmentos e outros metabolitos. Na interação F. mediterranea x Pa. chlamydospora (Figura 4, C1-C2), verifica-se um fenómeno oposto, uma vez que a colónia do primeiro fungo consegue crescer sobre Pa. chlamydospora.

Quando Pm. minimum é confrontado com ele próprio, há uma ligeira inibição do seu crescimento (coantagonismo), tal como no confronto com F. mediterranea (Figuras 4, D1-D2 e 5), sugerindo uma interação de antagonismo. Já no confronto com Pa. chlamydospora verifica-se favorecimento significativo do crescimento de Pm. minimum, indicando um fenómeno de agonismo (Figuras 4, E1-E2 e 5). Neste confronto, a cor da colónia de Pm. minimum sofre alterações, que são visíveis na face superior e inferior da mesma.

O fungo Pa. chlamydospora, no confronto com ele próprio ou com Pm. minimum, expressa um aumento pouco significativo de crescimento, mas uma situação oposta é observada no confronto com F. mediterranea, que origina inibição significativa do crescimento de Pa. chlamydospora (Figuras 4, F1-F2 e 5). A alteração da cor da colónia de Pa. chlamydospora (face superior), e de F. mediterranea (face inferior), assim como a formação da linha de confronto levemente acastanhada em torno de Pa. chlamydospora são visíveis, e podem ser resultantes das alterações fisiológicas e bioquímicas que ocorrem durante as interações.

Os resultados obtidos são dificilmente comparáveis aos de outros autores, pois a literatura existente sobre o assunto é escassa. Ainda assim, Sparapano et al. (2000b, 2001) verificaram relações de agonismo entre Pa. chlamydospora x Pm. minimum, bem como agonismo inicial na interação F. mediterranea x Pa. chlamydospora, seguido de crescimento de F. mediterranea sobre o segundo fungo. Também verificaram o efeito antagonista de Pm. minimum sobre Fomitiporia, idêntico ao observado no presente estudo.

Quando se confrontam em simultâneo os três principais fungos envolvidos na ”esca”, F. mediterranea, Pm. minimum e Pa. chlamydospora (Figura 4, G1-G2) observa-se novamente o efeito antagonista de Pm. minimum sobre F. mediterranea e, aparentemente, tal como observado por Sparapano et al. (2000b), este efeito parece estar a prevenir que o micélio de Fomitiporia se sobreponha ao de Pa. chlamydospora.

Por sua vez, as alterações morfológicas observadas em culturas pareadas são usuais e explicadas com base, entre outras, nas alterações sofridas pelo micélio de cada um dos fungos, na composição química dos metabolitos secundários produzidos e na síntese de compostos relacionados com o stresse (Boddy, 2000; Boddy et al., 2008; Arfi et al., 2013). Também o mecanismo de antibiose e a competição pelos nutrientes e espaço conduzem, em geral, a alterações morfológicas na zona frontal da interação entre colónias de fungos (Hiscox et al., 2010; Arfi et al., 2013).

A verificação destes resultados in planta impõe-se, para que conclusões mais robustas possam ser extraídas. Apesar deste constrangimento, o presente estudo sugere o favorecimento significativo do crescimento micelial dos agentes causais do pé negro da videira, I. liriodendri e D. macrodidyma, quando em presença dos agentes causais da doença de Petri, Pa. chlamydospora e Pm. minimum, o que pode explicar uma intensificação da severidade do pé negro na presença de Pa. chlamydospora e/ou Pm. minimum, por exemplo em vinhas jovens com sintomas de declínio. O isolamento simultâneo dos agentes causais daquelas duas doenças em Portugal é muito frequente (Rego et al., 2000; Oliveira et al., 2004) e os efeitos resultantes não serão exatamente aditivos.

No caso da “esca” da videira, a sucessão de fungos que coloniza o lenho da videira está ainda por determinar com rigor. A maioria dos autores sugere que os fungos Pa. chlamydospora e Pm. minimum (e outros, Phaeoacremonium spp., Botryosphaeriaceae e Eutypa spp.) poderão atuar como agentes primários da degradação do lenho, a que se seguirá a invasão por fungos de degradação secundária da madeira, como é o caso de F. mediterranea e de outros basidiomicetas (Larignon e Dubos, 1997). No entanto, fungos do género Fomitiporia também têm sido referidos como causadores de “white-rot”, mesmo na ausência dos fungos precursores, Pa. chlamydospora e Pm. minimum (Sparapano et al., 2000a), mas a hipótese de leveduras e bactérias não identificadas desempenharem um papel neste processo não pode ser descartada (Bruez et al., 2012; Hofstetter et al., 2012; Choueiri et al., 2014).

Trabalhos futuros deverão aprofundar os mecanismos de interação que se estabelecem não só entre os fungos estudados, mas sobretudo na sua interação com a planta, uma vez que as condições in vitro nem sempre reproduzem com exatidão os resultados obtidos em hospedeiro/substrato natural (Baptista et al., 2011).

CONCLUSÕES

Os fungos do género Dactylonectria e Ilyonectria, agentes causais do pé negro da videira são significativamente favorecidos pela presença de Pa. chlamydospora e Pm. minimum, responsáveis pela síndrome vascular da “esca”, necrose estriada em materiais de propagação vegetativa de videira e doença de Petri em videiras jovens. Por sua vez, estes últimos fungos, quando interagem entre si e com F. mediterranea revelam relações complexas, em que numa primeira fase Pa. chlamydospora e Pm. minimum exercem efeito agonista sobre F. mediterranea e, mais tarde, Pm. minimum comporta-se como antagonista de F. mediterranea, o que não acontece com Pa. chlamydospora.

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Recebido/received: 2018.01.20

Aceite/accepted: 2018.12.23