^I S. de Pediatria, Unidade Local de Saúde do Alto Minho. 4901-858 Viana do Castelo, Portugal. marinapinheiro25@gmail.com; arita_araujo@hotmail.com
^II S. de Pediatria do Centro Materno Infantil do Norte, Centro Hospitalar do Porto. 4099-001 Porto, Portugal. margguedes@gmail.com

ABSTRACT

Introduction: Tuberculosis is still a serious public health problem. To decrease the number of cases of active tuberculosis in populations of low and intermediate incidence, a rapid diagnosis and effective treatment is necessary. The tuberculin test is the recommended method of screening, but there are well-known limitations. Since 2001, the interferon gamma release assays have emerged, being considered useful in the diagnosis of latent infection with Mycobacterium tuberculosis and already widely used in adults.

Objectives: Summarize the available information on interferon gamma release assays, particularly with regard to the technique; advantages in the diagnosis of latent infection with Mycobacterium tuberculosis; sensitivity and specificity in the pediatric population; characterization of interfering factors; and their significance of monitoring of tuberculostatic treatment.

Development: Interferon gamma release assays are immunoassays that measure Interferon Gamma Release Assays response to Mycobacterium tuberculosis antigens. These tests have been applied in paediatrics population and in regions with different prevalence rates of tuberculosis, in order to compare them with the tuberculin skin test in regard to sensitivity and specificity.

Conclusions: Its usefulness as a means of screening in Paediatrics has limitations. Studies are needed at national level to identify how tuberculin skin test and interferon gamma release assays must be articulated. Currently, interferon gamma release assays only complement tuberculin skin test.

Keywords: Tuberculosis in children; Tuberculin skin test; QuantiFERON®-TB Gold In-tube; T-SPOT®.TB; Interferon Gamma Release Assay

RESUMO

Objectivos: Sumarizar a informação disponível sobre os interferon gamma release assays, nomeadamente no que diz respeito à técnica; às vantagens no diagnóstico da infeção latente por Mycobacterium tuberculosis; à sensibilidade e especificidade quando aplicados à população pediátrica; à caracterização de fatores interferentes; e ao seu significado na monitorização do tratamento com antituberculosos.

Desenvolvimento: Os interferon gamma release assays são testes imunologicamente seletivos, desenvolvidos com base em antigénios do Mycobacterium tuberculosis. Têm sido aplicados na Pediatria, em regiões com diferentes taxas de prevalência de tuberculose, de forma a compará-los com a prova tuberculínica relativamente à sensibilidade e especificidade.

Conclusões: A utilização destes testes como forma de rastreio em Pediatria apresenta limitações. São necessários estudos a nível nacional que permitam mostrar de que forma a prova tuberculínica e os interferon gamma release assays se devem articular. Atualmente, os interferon gamma release assays apenas complementam a prova tuberculínica.

Palavras-chave: Tuberculose infantil; Prova tuberculínica; QuantiFERON®-TB Gold In-tube; T-SPOT®.TB; Interferon Gamma Release Assay

A tuberculose (TB), apesar de ser uma doença evitável e curável, continua a ser um grave problema de saúde pública, sendo considerada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como uma emergência mundial. Em todo o mundo, estima-se que 9 milhões de pessoas tenham desenvolvido TB, dos quais 1,5 milhões acabaram por morrer. No total, 550.000 casos e

80.000 mortes ocorreram em crianças.1 Em Portugal, no ano de 2012, 69 casos foram diagnosticados antes dos 15 anos de idade, 43% dos quais em crianças com menos de cinco anos.2

Em países de baixa e intermédia incidência, como é o caso de Portugal, a estratégia para o controlo da TB implica diagnóstico e tratamento eficazes da infeção latente por Mt.5,6 Contudo, ao contrário do adulto, em que o diagnóstico de TB é direto, baseado na clínica e confirmado por exames culturais, na criança o diagnóstico de TB é muitas vezes indireto e depende da história epidemiológica e dos resultados da prova tuberculínica (PT).

A PT foi, durante muitos anos, o único teste disponível, pelo que as suas características e limitações são bem conhecidas (Quadro I e II).7-9 Em 2001, foi aprovado o primeiro de diversos interferon gamma release assays (IGRAs). Atualmente, estão comercializados dois testes, aprovados pela Food and Drug Administration: QuantiFERON®-TB Gold In-tube (QFT-GIT) (Cellestis Limited, Carnegie, Australia) e o T-SPOT®.TB (Oxford Immunotec, Abingdon, United Kingdom).10 A par com o que acontece com a maioria dos novos testes de diagnóstico, os primeiros estudos desenvolvidos e as consequentes primeiras recomendações foram efetuadas e validadas para a população adulta.

Pretende-se, neste artigo, através da revisão da literatura recente, sumarizar a informação disponível sobre os IGRAS, nomeadamente no que diz respeito à técnica; às vantagens no diagnóstico da infeção latente por Mt; à sensibilidade e especificidade quando aplicados à população pediátrica; à caracterização de fatores interferentes; e ao seu significado na monitorização do tratamento com antituberculosos.

No sentido de ultrapassar as limitações técnicas da PT e melhorar a sensibilidade e a especificidade no diagnóstico da infeção latente por Mt, foram desenvolvidos testes que se baseiam na resposta imunológica celular a antigénios do Mt: early secretory antigenic target 6 (ESAT-6), culture filtrate protein 10 (CFP-10) e TB7.7. Estes antigénios não estão presentes nem no Bacilo Calmette e Guérin (BCG) nem na maioria das micobactérias não tuberculosas (MNT) (exceto M. flavescens, M. marinum, M. kansasii e M. szulgai).11

Os IGRAs baseiam-se no princípio de que as células T de indivíduos previamente sensibilizados por antigénios do Mt libertam interferão gama (IFN-γ) quando reestimuladas por antigénios específicos, o qual pode, atualmente, ser medido pelos métodos enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) - QFT-GIT- e pelo enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) - T-SPOT®.TB.12

O teste QFT-GIT, que veio substituir o QuantiFERON®-TB Gold (QFT-G), deteta o nível de produção de IFN-γ em resposta aos antigénios ESAT-6, CFP-10 e TB7.7. Para cada doente, a colheita de sangue é incubada em três tubos – um contém os antigénios, outro o controlo positivo “mitogénio” com fitohemaglutinina e o último o controlo negativo, que contém apenas heparina. Os resultados são calculados através de um software de análise standard.11

No T-SPOT®.TB, os antigénios utilizados são o ESAT-6 e CFP-10. As moléculas de IFN-γ produzidas pelas células T do sangue periférico são colocadas numa placa contendo anticorpos monoclonais anti-IFNγ previamente imunizados, formando manchas expressas em Spot Forming Units (SFU).10

O T-SPOT®.TB é menos afetado por estados de imunossupressão - quantifica o número de células T produtoras de IFN-γ. Por sua vez, o QFT-GIT, que quantifica a concentração sérica de IFN-γ, tem uma técnica mais conveniente e menos dispendiosa.10,13 Uma alta produção de IFN-γ em resposta a antigénios do

Mt indica sensibilização prévia, e não necessariamente doença ativa. Tal como acontece com a PT, os IGRAs não permitem distinguir entre doença ativa e latente.14 Embora não exista uma prova gold standard para a infeção latente por Mt, e apesar de algumas limitações (Quadro III), os IGRAs, comparativamente à PT, têm vantagens no contexto de rastreio de contactos, especialmente se vacinados com BCG e/ou residentes em populações com taxas elevadas de exposição a MNT.3,5,8-11

Atualmente, vários artigos científicos e outros documentos normativos internacionais suportam a validade dos IGRAs em determinados grupos populacionais específicos. A Direção Geral de Saúde recomenda que os IGRAs sejam usados no diagnóstico da infeção latente por Mt apenas como complemento da PT, uma vez que subsistem ainda algumas incertezas quanto ao valor destes testes, particularmente em estados de imunossupressão e nas crianças.14

Desde 2001, foram publicados, em número crescente, vários estudos científicos com o objetivo de validar a utilização dos IGRAs como teste de diagnóstico de TB na população pediátrica. No entanto, verifica-se uma dificuldade comum e transversal a todos os estudos, resultante do fato da maioria das crianças com TB ativa não ter confirmação do diagnóstico por meio cultural, a prova absoluta de infeção indispensável à determinação da sensibilidade e especificidade destes testes.

A performance dos IGRAs tem sido, então, avaliada através das taxas de positividade de acordo com vários fatores, tais como graus de exposição ao Mt; idade; vacinação com BCG; prevalência de TB; estados de imunossupressão e análise da relação de concordância/discordância destes resultados com os da PT. O nível de concordância entre a PT e os IGRAs varia nos diferentes estudos pediátricos, com a estatística K a variar de 0,17 a 0,71.4,13,15-22

No diagnóstico de infeção latente por Mt, e perante resultados discordantes entre IGRAs e PT, a grande dificuldade está no fato de não ser possível determinar se o resultado negativo de um determinado teste ocorre porque este é mais específico ou se, pelo contrário, o resultado positivo de outro ocorreu por aquele ser mais sensível.

A sensibilidade dos IGRAs em crianças com TB ativa confirmada por cultura varia de 75 a 93%, sendo superior nos países com uma baixa prevalência de TB.9,12,19,23-26 Os IGRAs não são nem superiores nem inferiores à PT no diagnóstico da TB ativa em crianças, pelo que não podem ser utilizados para excluir doença ativa.9,12,19,22,27

Os resultados indeterminados são uma das principais limitações dos IGRAs, com uma percentagem que varia dos 0% aos 35%.13,24,28

Os IGRAs podem apresentar resultados indeterminados como consequência de erros técnicos, de elevada produção de IFN-γ no controle negativo ou, ainda, se o controle positivo com fitohemaglutinina (potente mitógenio estimulador de células T) determinar uma baixa ou nenhuma producão de IFN-γ. Uma baixa produção em resposta ao “mitogénio” pode ocorrer quando não existem linfócitos suficientes ou por incapacidade dos mesmos em gerar IFN-γ.3,11 Parece haver maior percentagem de resultados indeterminados com os QFT-G e QFT-GIT do que com o T-SPOT®.TB.7,9,28 No entanto, esta diferença não tem impacto clínico, pois a maioria dos resultados indeterminados do QFT são negativos com o T-SPOT®.TB.4

A performance dos IGRAs depende de uma resposta imune intacta, pelo que uma das principais causas dos resultados indeterminados é o estado de imunossupressão.3,13 Parece haver uma relação estatisticamente significativa entre contagens linfocitárias inferiores a 500 células/mm3 (p < 0.00005) e o aumento da incidência destes resultados. Assim, a utilização dos IGRAs, nestas condições, deve ser efetuada de forma prudente.29 Taxas mais elevadas de resultados indeterminados têm sido associadas a idade mais jovem, vírus de imunodeficiência humana (VIH), malnutrição, doença inflamatória intestinal mal controlada, infeção por helmintas,malária e anemia por défice de ferro.3,13,30-32 Está descrita ainda uma associação entre o resultado indeterminado e o risco de morte. Pensa-se que os estados de imunossupressão associados à doença grave, que condicionam taxas de mortalidade superiores, também contribuam para o aumento destes resultados.

Verificou-se uma relação inversamente proporcional entre a idade e a percentagem de resultados indeterminados. Embora se considere que a produção de IFN-γ aumenta com a idade, alguns estudos falharam na demonstração deste facto. Num estudo pediátrico recente, embora as crianças mais novas fossem aquelas com maior taxa de resultados indeterminados, verificou-se que também estas produziam um quantidade de IFN-γ semelhante às crianças mais velhas e adolescentes.4,17,18,22,24,31 Assim, acredita-se que o aumento do número de resultados indeterminados em crianças mais jovens reflete antes uma característica intrínseca dos IGRAs, em vez de uma deficiência de produção de IFN-γ em resposta aos antigénios e ao controlo positivo neste grupo.13,26

As crianças são mais vulneráveis ao desenvolvimento de TB devido à imaturidade do seu sistema imune. Como consequência, os testes baseados nas respostas das células T têm maior probabilidade de serem falsos negativos nas crianças do que nos adultos.19 O valor de cutoff para o QFT-GIT é de 0,35 IU/ml e foi estabelecido para adultos.18 Este valor não foi validado para a população pediátrica, havendo autores que sugerem valores próprios, ajustados às crianças.15 Todavia, estas sugestões não têm sido postas em prática, uma vez que podem condicionar um aumento do número de falsos positivos.13,17

O tempo decorrido entre a exposição ao Mt e a positividade dos IGRAs ainda não foi determinado, mas pensa-se ser semelhante aos da PT (8 semanas).15,16 Enquanto a PT é uma reação de hipersensibilidade tardia que mede as funções das células T efetoras e de memória, os IGRAs medem apenas a função de células T efetoras. Para se detetar a infeção após uma exposição remota, é necessário medir a resposta das células T de memória, menos provável de ocorrer nas 16-24 horas de tempo de incubação dos IGRAs. Em contraste, o tempo de incubação de 48-72 horas da PT permite o recrutamento de ambas as células T efetoras e de memória.18 Assim, crianças com IGRA positivo e PT negativa podem ter uma infeção recente, mas que ainda não teve tempo para que a conversão tuberculínica possa ter ocorrido.24 É provável que a conversão dos IGRAs e da PT não ocorra ao mesmo tempo, o que explica a variação dos níveis de concordância entre os IGRAs e a PT na literatura.16

Os resultados dos IGRAs não são estáveis, tendo-se verificado, num estudo pediátrico que 50% das crianças com IGRAs positivo obtiveram um resultado negativo ao fim de três semanas. Essa flutuação pode representar não só a variação do próprio ciclo de produção de IFN-γ, como também eventuais erros técnicos.20 De forma a reduzir estes últimos, recomenda-se que a recolha de sangue seja efetuada por um técnico experiente, que o tempo decorrido desde a colheita até à incubação seja semelhante para todas as amostras e que o processamento das amostras cumpra as recomendações do fabricante.17

A aplicabilidade dos IGRAs pode, também, ser limitada pelo volume de sangue necessário à realização do teste, especialmente em crianças mais pequenas. O QFT-GIT implica a colheita de 3 ml de sangue e o T-SPOT®.TB de 8 ml. Numa tentativa de eliminar esta limitação, a empresa Cellestis desenvolveu um protótipo do QFT-GIT que requer apenas 0,9 ml de sangue – QuantiFERON microtube (QFT-MT). É um teste promissor, mas que necessita ainda de estudos em grande escala, controlados e prospetivos, que validem a sua utilização.34

A grande variabilidade de resultados obtidos nos diversos estudos relativamente à validade dos IGRAs poderá, assim, ser explicada pelos seguintes fatores: prevalência da TB; vacinação pelo BCG; infeção por MNT; tipo de estudo; idade da população testada; critérios de definição de TB ativa; mecanismos imunológicos distintos entre a PT e o IGRA; resultado indeterminado; tipo de IGRA utilizado; e erros técnicos.

A ideia de que a atividade das células T produtoras de IFN-γ diminui durante o tratamento antituberculoso tem gerado interesse na comunidade científica, com diversos estudos realizados com o propósito de avaliar o seu valor potencial como instrumento de monitorização e follow-up do tratamento. De fato, observou-se uma diminuição dos valores do IFN-γ durante o tratamento antituberculoso. Contudo, não se verificou uma diferença significativa no número de resultados positivos 6 meses após o tratamento.35 A taxa de conversão para o QFT-GIT e T-SPOT®.TB varia de 6 a 39% e de 9 a 14%, respetivamente.35,36 As baixas taxas de conversão, apesar do tratamento antituberculoso eficaz, podem acontecer porque: 1) a exposição contínua ao Mt pode perpetuar uma resposta imune ao longo do tempo; 2) as células T efetoras podem persistir em circulação durante mais tempo, mesmo após a erradicação da doença; 3) as conversões podem meramente refletir as flutuações na produção de IFN-γ ou a variabilidade inerente às diferentes técnicas laboratoriais.36

Apesar de promissores, os estudos tem demonstrado que os IGRAs seriados têm uma utilidade limitada em crianças submetidas a tratamento antituberculosos.

A utilização dos IGRAs continua condicionada pela incapacidade de se determinar a sua efetividade, pois não existe um teste gold standard de diagnóstico passível de comparação. Assim, a definição da sua aplicabilidade só pode ser feita através da relação entre probabilidade de exposição ao Mt e resultados da PT.

A associação entre uma resposta imunológica menos efetiva e a maior suscetilidade das crianças à TB torna-as num grupo de risco, onde a PT parece apresentar mais vantagens nas crianças com menos de cinco anos de idade. Um IGRA negativo não exclui a presença de TB em crianças.

A maioria das limitações que os IGRAs apresentam poderão ser ultrapassadas através da caracterização das variáveis que interferem com a produção do IFN-γ; estabelecimento de valores de cutoff mediante a idade; standardização da definição de resultado indeterminado; simplificação da técnica e consequente diminuição dos custos; apresentação dos resultados em valores quantitativos da cultura do mitogénio, o que pode permitir distinguir o erro técnico da incapacidade de produção de IFN-γ. Para melhor caracterizar quanto à sua sensibilidade e especificidade, são necessários estudos prospetivos capazes de determinar o número de crianças com PT positiva e IGRA negativo não tratadas para a infeção latente por Mt e que mais tarde virão a desenvolver doença. Atualmente, os IGRAs apenas complementam a PT.

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Endereço para correspondência
Marina Pinheiro: ]]> Unidade Local de Saúde do Alto Minho Serviço de Pediatria
Estrada de Santa Luzia
4901-858 Viana do Castelo, Portugal.

E-mail: marinapinheiro25@gmail.com

Recebido a 13.05.2014 | Aceite a 28.07.2015